GFAT1 Antibody [D8D23] Datasheet

生物描述

特异性	GFAT1 Antibody [D8D23] 可检测内源性 GFAT1 总蛋白水平。
背景	谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶1 (GFAT1) 是己糖胺生物合成途径 (HBP) 的限速酶，催化果糖-6-磷酸和谷氨酰胺转化为葡萄糖胺-6-磷酸和谷氨酸。HBP 为蛋白质和脂质糖基化提供必需的前体，将细胞代谢与信号传导和转录调控联系起来。GFAT1 活性失调与代谢疾病有关，该途径的通量增强会导致高血糖引起的胰岛素抵抗，并在非胰岛素依赖型糖尿病 (NIDDM) 中报告酶活性增加。另一种同工酶 GFAT2 已被鉴定具有独特的调控机制，表明 HBP 活性受到组织特异性调控。除了代谢调节之外，GFAT1 与肿瘤发生的关联也日益密切。 AMPK介导的GFAT1磷酸化促进VEGF驱动的血管生成，其在胰腺癌干细胞中的过表达支持肿瘤的发生和生长，而敲低GFAT1则在体外和体内抑制恶性肿瘤。在乳腺癌中，GFAT1升高与不良预后和缩短的无病生存期相关，尤其是在侵袭性亚型中。在肺癌和胆管癌中也观察到异常表达，其中GFAT1维持细胞增殖和存活，而在胆管癌中，高糖诱导的GFAT1上调促进细胞迁移和侵袭。在膀胱癌中，GFAT1活性升高会增加HBP通量，增强丝氨酰-tRNA合成酶（SerRS）的O-GlcNAc糖基化，阻止其核定位，并驱动血管生成。总而言之，GFAT1是一种关键的代谢酶，将营养感知与致癌信号传导和癌症进展联系起来。

特异性

GFAT1 Antibody [D8D23] 可检测内源性 GFAT1 总蛋白水平。

背景

谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶1 (GFAT1) 是己糖胺生物合成途径 (HBP) 的限速酶，催化果糖-6-磷酸和谷氨酰胺转化为葡萄糖胺-6-磷酸和谷氨酸。HBP 为蛋白质和脂质糖基化提供必需的前体，将细胞代谢与信号传导和转录调控联系起来。GFAT1 活性失调与代谢疾病有关，该途径的通量增强会导致高血糖引起的胰岛素抵抗，并在非胰岛素依赖型糖尿病 (NIDDM) 中报告酶活性增加。另一种同工酶 GFAT2 已被鉴定具有独特的调控机制，表明 HBP 活性受到组织特异性调控。除了代谢调节之外，GFAT1 与肿瘤发生的关联也日益密切。 AMPK介导的GFAT1磷酸化促进VEGF驱动的血管生成，其在胰腺癌干细胞中的过表达支持肿瘤的发生和生长，而敲低GFAT1则在体外和体内抑制恶性肿瘤。在乳腺癌中，GFAT1升高与不良预后和缩短的无病生存期相关，尤其是在侵袭性亚型中。在肺癌和胆管癌中也观察到异常表达，其中GFAT1维持细胞增殖和存活，而在胆管癌中，高糖诱导的GFAT1上调促进细胞迁移和侵袭。在膀胱癌中，GFAT1活性升高会增加HBP通量，增强丝氨酰-tRNA合成酶（SerRS）的O-GlcNAc糖基化，阻止其核定位，并驱动血管生成。总而言之，GFAT1是一种关键的代谢酶，将营养感知与致癌信号传导和癌症进展联系起来。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

80 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: RD, Lane 3: INS-1