GRK 2/3 (βARK 1/2) Antibody [K24G8] Datasheet

生物描述

特异性	GRK 2/3 (βARK 1/2) Antibody [K24G8] 可检测内源性 GRK 2/3 (βARK 1/2) 总蛋白水平。
背景	G蛋白偶联受体 (GPCR) 是膜蛋白家族中最大、最多样化的家族之一，负责通过激活各种第二信使途径将细胞外信号转导至细胞内反应。GPCR 信号的精确调控对于维持细胞响应至关重要，其终止主要通过 G 蛋白偶联受体激酶 (GRK) 及其衔接蛋白 β-arrestins 介导的同源脱敏来实现。与配体结合后，GRK 磷酸化激活的 GPCR，为 β-arrestins 提供锚定位点，进而促进受体内化、信号终止和受体运输。GRK 家族包含六种亚型 (GRK1-6)，每种亚型都表现出不同的底物偏好、细胞定位和调控机制。其中，GRK2 和 GRK3，也称为 β-肾上腺素能受体激酶（βARK1 和 βARK2），在多种受体系统的调控中发挥关键作用。 GRK2 和 GRK3 的一个显著特征是其 C 末端区域存在一个普莱克底物同源性 (PH) 结构域——这是一种在多种信号传导和细胞骨架蛋白中发现的保守结构基序。该结构域介导与异源三聚体 G 蛋白的 Gβγ 亚基的直接相互作用，从而增强 GRK 的催化活性并促进其转位至质膜，使其能够有效地进行受体磷酸化。此外，带负电荷的膜磷脂已被证明能够选择性结合并调节 GRK2 和 GRK3 的活性，影响它们磷酸化底物（例如 hm2 毒蕈碱乙酰胆碱受体 (mAChR)，这是 GRK 介导脱敏的典型模型）的能力。

特异性

GRK 2/3 (βARK 1/2) Antibody [K24G8] 可检测内源性 GRK 2/3 (βARK 1/2) 总蛋白水平。

背景

G蛋白偶联受体 (GPCR) 是膜蛋白家族中最大、最多样化的家族之一，负责通过激活各种第二信使途径将细胞外信号转导至细胞内反应。GPCR 信号的精确调控对于维持细胞响应至关重要，其终止主要通过 G 蛋白偶联受体激酶 (GRK) 及其衔接蛋白 β-arrestins 介导的同源脱敏来实现。与配体结合后，GRK 磷酸化激活的 GPCR，为 β-arrestins 提供锚定位点，进而促进受体内化、信号终止和受体运输。GRK 家族包含六种亚型 (GRK1-6)，每种亚型都表现出不同的底物偏好、细胞定位和调控机制。其中，GRK2 和 GRK3，也称为 β-肾上腺素能受体激酶（βARK1 和 βARK2），在多种受体系统的调控中发挥关键作用。 GRK2 和 GRK3 的一个显著特征是其 C 末端区域存在一个普莱克底物同源性 (PH) 结构域——这是一种在多种信号传导和细胞骨架蛋白中发现的保守结构基序。该结构域介导与异源三聚体 G 蛋白的 Gβγ 亚基的直接相互作用，从而增强 GRK 的催化活性并促进其转位至质膜，使其能够有效地进行受体磷酸化。此外，带负电荷的膜磷脂已被证明能够选择性结合并调节 GRK2 和 GRK3 的活性，影响它们磷酸化底物（例如 hm2 毒蕈碱乙酰胆碱受体 (mAChR)，这是 GRK 介导脱敏的典型模型）的能力。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB

1:200 - 1:2000

反应性

Rat, Mouse, Bovine, Chicken, Human, Rabbit, Pig

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

80 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: 3T3, Lane 2: A431, Lane 3: Hela