Hantavirus nucleocapsid protein Antibody (Mouse mAb) [A11N7] Datasheet

生物描述

特异性	Hantavirus nucleocapsid protein Antibody (Mouse mAb) [A11N7] 可检测感染细胞、组织或含病毒样本中的 Hantavirus nucleocapsid 蛋白。
背景	汉坦病毒核衣壳蛋白由其小基因组片段编码，是病毒颗粒中最丰富的结构蛋白，它作为一种负链RNA病毒核蛋白，将病毒基因组包裹成核糖核蛋白复合物，作为病毒RNA依赖性RNA聚合酶转录和复制的模板。晶体结构分析显示，该蛋白具有双叶结构，主要由α螺旋构成，与正布尼亚病毒的核蛋白结构有一定关联，其碱性RNA结合口袋位于两个叶之间的界面处；核衣壳蛋白的寡聚化并非通过单一的独立界面，而是由延伸的氨基末端和羧基末端臂介导，这些臂伸出并结合相邻的单体，这与生化实验观察到的头对头、尾对尾的组装模式相符。氨基末端区域形成反平行卷曲螺旋结构，由共享的疏水残基稳定，该卷曲螺旋片段驱动三聚体中间体的形成，该中间体代表组装检查点，在整合到更高级的寡聚核糖核蛋白复合物之前；该卷曲螺旋内的带电残基进一步促进分子间接触，从而稳定三聚体的形成，而不仅仅依赖于疏水核心。核衣壳蛋白的功能远不止被动地包裹基因组RNA：它还能与病毒RNA依赖性RNA聚合酶直接相互作用。聚合酶结合域位于核衣壳蛋白的N端，而相应的核衣壳结合口袋则位于聚合酶的C端。通过靶向突变破坏这种核衣壳-聚合酶相互作用，会消除感染过程中聚合酶的功能，从而证实这种蛋白质-蛋白质接触是病毒RNA合成的必要机制，而非基因组包装的偶然环节。此外，核衣壳蛋白还参与分节段负链RNA病毒特有的“帽窃取”机制，它能结合宿主信使RNA的帽结构（需要帽结构两侧相邻的四个核苷酸），保护这些加帽片段免受细胞脱帽机制的破坏，并将其储存起来，供聚合酶后续用作引物启动病毒转录。由于 RNA 结合、寡聚化和聚合酶参与是结构上可分离的功能，分别映射到同一蛋白质的不同区域，因此核衣壳蛋白呈现出多个离散的表面，可用于基于结构的抗病毒设计。

特异性

Hantavirus nucleocapsid protein Antibody (Mouse mAb) [A11N7] 可检测感染细胞、组织或含病毒样本中的 Hantavirus nucleocapsid 蛋白。

背景

汉坦病毒核衣壳蛋白由其小基因组片段编码，是病毒颗粒中最丰富的结构蛋白，它作为一种负链RNA病毒核蛋白，将病毒基因组包裹成核糖核蛋白复合物，作为病毒RNA依赖性RNA聚合酶转录和复制的模板。晶体结构分析显示，该蛋白具有双叶结构，主要由α螺旋构成，与正布尼亚病毒的核蛋白结构有一定关联，其碱性RNA结合口袋位于两个叶之间的界面处；核衣壳蛋白的寡聚化并非通过单一的独立界面，而是由延伸的氨基末端和羧基末端臂介导，这些臂伸出并结合相邻的单体，这与生化实验观察到的头对头、尾对尾的组装模式相符。氨基末端区域形成反平行卷曲螺旋结构，由共享的疏水残基稳定，该卷曲螺旋片段驱动三聚体中间体的形成，该中间体代表组装检查点，在整合到更高级的寡聚核糖核蛋白复合物之前；该卷曲螺旋内的带电残基进一步促进分子间接触，从而稳定三聚体的形成，而不仅仅依赖于疏水核心。核衣壳蛋白的功能远不止被动地包裹基因组RNA：它还能与病毒RNA依赖性RNA聚合酶直接相互作用。聚合酶结合域位于核衣壳蛋白的N端，而相应的核衣壳结合口袋则位于聚合酶的C端。通过靶向突变破坏这种核衣壳-聚合酶相互作用，会消除感染过程中聚合酶的功能，从而证实这种蛋白质-蛋白质接触是病毒RNA合成的必要机制，而非基因组包装的偶然环节。此外，核衣壳蛋白还参与分节段负链RNA病毒特有的“帽窃取”机制，它能结合宿主信使RNA的帽结构（需要帽结构两侧相邻的四个核苷酸），保护这些加帽片段免受细胞脱帽机制的破坏，并将其储存起来，供聚合酶后续用作引物启动病毒转录。由于 RNA 结合、寡聚化和聚合酶参与是结构上可分离的功能，分别映射到同一蛋白质的不同区域，因此核衣壳蛋白呈现出多个离散的表面，可用于基于结构的抗病毒设计。

使用信息

抗体应用

WB, ELISA

稀释比例

WB

1:1000 - 1:5000

反应性

Hantavirus Puumala strain

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

48 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 180s 以上)

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 180s 以上)

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Recombinant HTNV Nucleocapsid/NP protein