HDAC4 Rabbit mAb Datasheet

生物描述

特异性	HDAC4 Rabbit mAb识别内源性HDAC4总蛋白水平。
背景	组蛋白乙酰化和去乙酰化对于调节基因转录至关重要。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 介导，该酶通过松解染色质结构以增强转录。相反，组蛋白去乙酰化由组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 催化，可导致染色质凝聚和转录抑制。根据其大小、序列同源性和复合物形成，HDAC 分为三类 - I、II 和 III。在 II 类 HDAC 中，HDAC4 在调节对各种细胞功能至关重要的基因表达方面发挥着重要作用。HDAC4 具有独特的 N 端调节域，可与特定转录因子相互作用，以及 C 端含锌催化域。晶体结构分析表明，正确折叠的锌结合域对于形成阻遏复合物至关重要。HDAC4 的翻译后修饰会影响其亚细胞定位和与其他蛋白质的相互作用。 HDAC4 的一个关键功能是通过调节染色质凝聚和结构来介导转录抑制。翻译后修饰，特别是可逆磷酸化，对 HDAC4 的调节功能至关重要。HDAC4 与 14-3-3 蛋白家族相互作用，该家族特异性地与含磷酸丝氨酸的基序结合。HDAC4 可以被各种激酶磷酸化，包括钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 (CaMK)、细胞外信号调节激酶 1 和 2 (ERK1/2)、蛋白激酶 A (PKA) 和糖原合酶激酶 3 (GSK3)。通过其在调节基因转录、细胞生长、存活和增殖中的作用，HDAC4 的失调或异常活性均可能导致癌症发生和发展。

特异性

HDAC4 Rabbit mAb识别内源性HDAC4总蛋白水平。

背景

组蛋白乙酰化和去乙酰化对于调节基因转录至关重要。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 介导，该酶通过松解染色质结构以增强转录。相反，组蛋白去乙酰化由组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 催化，可导致染色质凝聚和转录抑制。根据其大小、序列同源性和复合物形成，HDAC 分为三类 - I、II 和 III。在 II 类 HDAC 中，HDAC4 在调节对各种细胞功能至关重要的基因表达方面发挥着重要作用。HDAC4 具有独特的 N 端调节域，可与特定转录因子相互作用，以及 C 端含锌催化域。晶体结构分析表明，正确折叠的锌结合域对于形成阻遏复合物至关重要。HDAC4 的翻译后修饰会影响其亚细胞定位和与其他蛋白质的相互作用。 HDAC4 的一个关键功能是通过调节染色质凝聚和结构来介导转录抑制。翻译后修饰，特别是可逆磷酸化，对 HDAC4 的调节功能至关重要。HDAC4 与 14-3-3 蛋白家族相互作用，该家族特异性地与含磷酸丝氨酸的基序结合。HDAC4 可以被各种激酶磷酸化，包括钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 (CaMK)、细胞外信号调节激酶 1 和 2 (ERK1/2)、蛋白激酶 A (PKA) 和糖原合酶激酶 3 (GSK3)。通过其在调节基因转录、细胞生长、存活和增殖中的作用，HDAC4 的失调或异常活性均可能导致癌症发生和发展。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:2000	1:100

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit

MW

140 kda

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN₃

储存条件
(自收到货起)

–20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Wang Z, et al. Epigenomics. 2014 Feb;6(1):139-50.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: 293
Lane 2: Hela
Lane 3: H-4-II-E