HEC1/HEC Antibody (Rabbit mAb) [H9F1] Datasheet

生物描述

特异性	HEC1/HEC Antibody (Rabbit mAb) [H9F1] 可检测内源性 HEC1/HEC 总蛋白水平。
背景	HEC1，也称为NDC80，是四蛋白复合物NDC80的核心结构亚基，该复合物还包括NUF2、SPC24和SPC25。在有丝分裂过程中，该复合物构成着丝粒和纺锤体微管之间必不可少的、进化上保守的物理接触点。该复合物组装成一个高度细长的棒状结构，长度约为60纳米，由成对的卷曲螺旋区域构成，两端带有球状功能域；HEC1和NUF2的N端球状结构域共同折叠成一对钙调蛋白同源结构域，该折叠在结构上与微管正端追踪蛋白EB1的微管结合结构域相关；此外，HEC1还带有一个无序的、带正电荷的N端尾部，延伸至该结构域之外。微管结合是通过钙调蛋白同源界面实现的，该界面主要通过 CH 结构域和 HEC1 尾部的正电荷与微管蛋白酸性 C 端尾部的负电荷之间的静电接触进行协同结合。人类细胞中的基因沉默和拯救实验表明，HEC1 CH 结构域、NUF2 CH 结构域和 HEC1 尾部各自通过不同的机制作用促进动粒-微管连接，而不是功能冗余。非结构化的HEC1尾部特异性地增强了纯化的N端HEC1片段和重组的NDC80复合物在体外与微管的结合亲和力，去除该尾部则显著降低了这种亲和力。而引入CH结构域本身的点突变会阻止着丝粒在细胞内与微管进行有效的连接和染色体排列，并且这种CH结构域突变表型无法通过阻断Aurora B介导的尾部磷酸化来挽救，这表明CH结构域和尾部执行着彼此独立的功能，不能相互替代。这种连接直接受Aurora B激酶的调控，Aurora B激酶磷酸化无序HEC1尾部结构域内的多个位点，从而降低NDC80复合物与微管的结合亲和力，削弱着丝粒-微管连接，尤其是在缺乏适当张力或双极取向的着丝粒处，从而提供了一种核心的错误校正机制，使错误的连接能够脱离并重新形成。这种对张力敏感、Aurora B 可调的结合亲和力作用于纺锤体组装检查点的上游，因为 NUF2 和 HEC1 还对于将检查点蛋白 MAD1 和 MAD2 保留在着丝粒上是必需的，它将微管附着的物理强度直接与监视机制联系起来，该机制会延迟后期开始，直到所有染色体都实现稳定的双向附着，而这种附着的破坏会导致许多癌症所特有的染色体不稳定和非整倍体。

特异性

HEC1/HEC Antibody (Rabbit mAb) [H9F1] 可检测内源性 HEC1/HEC 总蛋白水平。

背景

HEC1，也称为NDC80，是四蛋白复合物NDC80的核心结构亚基，该复合物还包括NUF2、SPC24和SPC25。在有丝分裂过程中，该复合物构成着丝粒和纺锤体微管之间必不可少的、进化上保守的物理接触点。该复合物组装成一个高度细长的棒状结构，长度约为60纳米，由成对的卷曲螺旋区域构成，两端带有球状功能域；HEC1和NUF2的N端球状结构域共同折叠成一对钙调蛋白同源结构域，该折叠在结构上与微管正端追踪蛋白EB1的微管结合结构域相关；此外，HEC1还带有一个无序的、带正电荷的N端尾部，延伸至该结构域之外。微管结合是通过钙调蛋白同源界面实现的，该界面主要通过 CH 结构域和 HEC1 尾部的正电荷与微管蛋白酸性 C 端尾部的负电荷之间的静电接触进行协同结合。人类细胞中的基因沉默和拯救实验表明，HEC1 CH 结构域、NUF2 CH 结构域和 HEC1 尾部各自通过不同的机制作用促进动粒-微管连接，而不是功能冗余。非结构化的HEC1尾部特异性地增强了纯化的N端HEC1片段和重组的NDC80复合物在体外与微管的结合亲和力，去除该尾部则显著降低了这种亲和力。而引入CH结构域本身的点突变会阻止着丝粒在细胞内与微管进行有效的连接和染色体排列，并且这种CH结构域突变表型无法通过阻断Aurora B介导的尾部磷酸化来挽救，这表明CH结构域和尾部执行着彼此独立的功能，不能相互替代。这种连接直接受Aurora B激酶的调控，Aurora B激酶磷酸化无序HEC1尾部结构域内的多个位点，从而降低NDC80复合物与微管的结合亲和力，削弱着丝粒-微管连接，尤其是在缺乏适当张力或双极取向的着丝粒处，从而提供了一种核心的错误校正机制，使错误的连接能够脱离并重新形成。这种对张力敏感、Aurora B 可调的结合亲和力作用于纺锤体组装检查点的上游，因为 NUF2 和 HEC1 还对于将检查点蛋白 MAD1 和 MAD2 保留在着丝粒上是必需的，它将微管附着的物理强度直接与监视机制联系起来，该机制会延迟后期开始，直到所有染色体都实现稳定的双向附着，而这种附着的破坏会导致许多癌症所特有的染色体不稳定和非整倍体。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:500-1:1000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

74 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:10000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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