HEF1/NEDD9 Antibody [M16B3] Datasheet

生物描述

特异性	HEF1/NEDD9 Antibody [M16B3] 可检测内源性 HEF1/NEDD9 总蛋白水平。
背景	HEF1，又称 NEDD9 或 Cas-L，是 Cas 家族中的关键多结构域衔接蛋白，在细胞间期协调粘着斑处的整合素介导的信号传导，并在 G2/M 期定位到中心体和有丝分裂结构，以调节细胞粘附、迁移、极性和存活。 HEF1 包含一个 N 端 SH3 结构域（残基 3-65），用于结合富含脯氨酸的蛋白质；一个底物结构域（残基 110-356），富含酪氨酸基序，如 Y189 和 Y214，这些基序可被 Src 和 FAK 磷酸化，以募集含有 SH2 结构域的效应分子，如 Crk 和 Abl；一个富含丝氨酸的区域（残基 357-560），形成四螺旋束，以维持结构稳定性并促进蛋白质相互作用；以及一个 C 端粘着斑靶向 (FAT) 结构域（残基 561-834），具有螺旋-环-螺旋基序，可促进 FAK 对接、Src 结合和二聚化。 HEF1整合来自FAK、Src、PDGFR和Abl的信号，导致其底物结构域磷酸化，并组装信号复合物，从而促进肌动蛋白细胞骨架重塑、黏着斑周转、通过MMP9分泌形成侵袭伪足，以及激活FAK-Src-Aurora-A等趋化通路和有丝分裂进程；其磷酸化动态变化进一步调控细胞凋亡抵抗和上皮-间质转化。NEDD9过表达通过增强侵袭和存活信号，驱动胶质母细胞瘤、黑色素瘤和肺癌等癌症的转移，而NEDD9缺陷则会损害肿瘤进展和白细胞迁移。

特异性

HEF1/NEDD9 Antibody [M16B3] 可检测内源性 HEF1/NEDD9 总蛋白水平。

背景

HEF1，又称 NEDD9 或 Cas-L，是 Cas 家族中的关键多结构域衔接蛋白，在细胞间期协调粘着斑处的整合素介导的信号传导，并在 G2/M 期定位到中心体和有丝分裂结构，以调节细胞粘附、迁移、极性和存活。 HEF1 包含一个 N 端 SH3 结构域（残基 3-65），用于结合富含脯氨酸的蛋白质；一个底物结构域（残基 110-356），富含酪氨酸基序，如 Y189 和 Y214，这些基序可被 Src 和 FAK 磷酸化，以募集含有 SH2 结构域的效应分子，如 Crk 和 Abl；一个富含丝氨酸的区域（残基 357-560），形成四螺旋束，以维持结构稳定性并促进蛋白质相互作用；以及一个 C 端粘着斑靶向 (FAT) 结构域（残基 561-834），具有螺旋-环-螺旋基序，可促进 FAK 对接、Src 结合和二聚化。 HEF1整合来自FAK、Src、PDGFR和Abl的信号，导致其底物结构域磷酸化，并组装信号复合物，从而促进肌动蛋白细胞骨架重塑、黏着斑周转、通过MMP9分泌形成侵袭伪足，以及激活FAK-Src-Aurora-A等趋化通路和有丝分裂进程；其磷酸化动态变化进一步调控细胞凋亡抵抗和上皮-间质转化。NEDD9过表达通过增强侵袭和存活信号，驱动胶质母细胞瘤、黑色素瘤和肺癌等癌症的转移，而NEDD9缺陷则会损害肿瘤进展和白细胞迁移。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

105 kDa, 115 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: A549, Lane 2: C2C12