HEPACAM Antibody (Rabbit mAb) [E11A10]

目录号：F5802

打印

生物描述

特异性 HEPACAM Antibody (Rabbit mAb) [E11A10] 可检测内源性 HEPACAM 总蛋白水平。
背景 HEPACAM，又称GlialCAM，是一种富含于神经胶质细胞的免疫球蛋白样细胞黏附分子，在细胞间和细胞-基质接触界面发挥作用，组织神经组织和其他组织内的神经胶质结构和信号传导。该蛋白包含胞外Ig样结构域、单个跨膜区段以及糖基化和磷酸化的胞质尾，能够在细胞表面形成顺式同源二聚体。这种结构排列支持其在细胞间连接处的侧向聚集，以及沿细胞突起和基底膜定位，从而与细胞外基质成分相互作用。HEPACAM通过其完整的胞外和胞质结构域促进细胞在纤连蛋白和基质胶上的铺展，延缓细胞脱落并促进伤口愈合，表明其在调节肌动蛋白依赖的细胞-基质黏附和运动中发挥直接作用。胞质尾部的缺失会减弱这些效应，凸显胞质连接对于将黏附信号传递至细胞骨架的重要性。HEPACAM 与 F-肌动蛋白的直接相互作用以及与 E-钙黏蛋白等连接分子的共定位，将 HEPACAM 与皮质肌动蛋白网络以及上皮或胶质细胞连接复合物连接起来，从而提供了一个将表面黏附与细胞内结构组织和生长控制联系起来的支架。在星形胶质细胞中，HEPACAM 与连接蛋白 43 结合，并稳定其在质膜连接处的定位，通过限制溶酶体降解来提高连接蛋白 43 的蛋白水平，从而支持胶质细胞之间牢固的间隙连接。 HEPACAM的缺失或突变会破坏这种关联，加速连接蛋白43的周转，并损害间隙连接的通讯，从而导致星形胶质细胞排列缺陷、星形胶质细胞形态复杂性降低以及抑制性突触密度和微型抑制性突触后电流幅度改变。这些改变将HEPACAM依赖的连接组织与皮层回路中突触兴奋和抑制的平衡联系起来。在发育过程中，星形胶质细胞中富集的HEPACAM参与跨细胞和细胞-细胞外基质（ECM）相互作用，塑造神经毡内星形胶质细胞的区域，并调节突起如何包裹突触，使其表达水平成为星形胶质细胞形态发生和区域形成的一个决定性因素。在胶质母细胞瘤模型中，肿瘤细胞中HEPACAM的重新表达诱导分化，其特征为胶质纤维酸性蛋白（GFAP）增加、细胞周期调控因子谱改变、增殖和迁移能力降低以及黏附能力增强，这表明HEPACAM发挥抑癌作用，使细胞从侵袭性强、自我更新的状态转变为分化程度更高、运动能力更弱的表型。在胶质母细胞瘤干细胞样细胞中进行HEPACAM基因靶向，可促进细胞从增殖向侵袭的转变，并伴有黏着斑信号的激活和与脑细胞外基质（ECM）黏附能力的增强，这表明HEPACAM通路平衡了ECM黏附和细胞内信号传导，从而控制脑实质内生长和扩散之间的权衡。 HEPACAM 的种系突变与皮质下囊肿的巨脑白质脑病有关，其中有缺陷的 GlialCAM 无法将 MLC1 和 ClC-2 正确运输到星形胶质细胞连接处，并可能扰乱神经胶质通讯和白质完整性，将其连接运输功能与脑白质营养不良的发病机制联系起来。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:2000 1:500
反应性 Rat, Mouse, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 46 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 90s 以上)。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain