HIF1AN/FIH-1 Antibody (Rabbit mAb) [G7L22] Datasheet

生物描述

特异性	HIF1AN/FIH-1 Antibody (Rabbit mAb) [G7L22] 可检测内源性 HIF1AN/FIH-1 总蛋白水平。
背景	FIH-1，也称为 HIF1AN，是一种 2-酮戊二酸和 Fe(II) 依赖性双加氧酶，催化天冬酰胺羟基化，靶向 HIF-α C 端转录激活结构域内保守的天冬酰胺残基。这种修饰阻断了转录共激活因子 p300 和 CBP 向 HIF 的募集，从而抑制 HIF 的转录活性，且该抑制作用独立于通过 VHL 控制 HIF-α 蛋白稳定性的脯氨酰羟基化途径。除了这种经典的 HIF 底物外，FIH 还能有效地羟基化一类结构不同的蛋白质，这类蛋白质含有锚蛋白重复结构域。生化筛选发现 NF-κB 家族蛋白 p105 和 IκB-α 的锚蛋白重复结构域是 FIH 的直接底物，羟基化发生在连接各个锚蛋白重复序列的发夹环内的特定天冬酰胺残基上。该靶向天冬酰胺位于锚蛋白重复序列共识结构中高度保守的序列内，并且来自许多其他含有锚蛋白重复结构域的蛋白质的肽段在体外支持FIH的催化活性，这表明FIH识别的是锚蛋白重复折叠中共享的广泛结构基序，而非单一的独特序列。这种双重底物特异性（HIF-α的CTAD结构域与NF-κB通路组分、Notch、ASB4和其他蛋白质中发现的锚蛋白重复结构域）使FIH成为缺氧反应与其他信号通路之间潜在的分子串扰点，因为HIF-α和锚蛋白重复结构域底物对有限的FIH酶池的竞争可能使一类底物调节另一类底物的羟基化，进而调控其活性。 FIH的催化活性需要分子氧作为羟基化反应的共底物，这使得FIH介导的HIF及其锚蛋白重复结构域底物的抑制作用直接与细胞氧张力相关。由于FIH的氧敏感性动力学与控制HIF-α稳定性的脯氨酰羟化酶不同，FIH作为第二个生化性质不同的氧感知输入，最终作用于同一HIF转录因子。除了其已知的氧感知功能外，FIH还作为细胞代谢的调节因子。这种代谢调节作用，连同其已知的对血管生成HIF靶基因转录的抑制作用，将FIH活性与代谢紊乱以及缺氧肿瘤微环境中的肿瘤血管生成联系起来。

特异性

HIF1AN/FIH-1 Antibody (Rabbit mAb) [G7L22] 可检测内源性 HIF1AN/FIH-1 总蛋白水平。

背景

FIH-1，也称为 HIF1AN，是一种 2-酮戊二酸和 Fe(II) 依赖性双加氧酶，催化天冬酰胺羟基化，靶向 HIF-α C 端转录激活结构域内保守的天冬酰胺残基。这种修饰阻断了转录共激活因子 p300 和 CBP 向 HIF 的募集，从而抑制 HIF 的转录活性，且该抑制作用独立于通过 VHL 控制 HIF-α 蛋白稳定性的脯氨酰羟基化途径。除了这种经典的 HIF 底物外，FIH 还能有效地羟基化一类结构不同的蛋白质，这类蛋白质含有锚蛋白重复结构域。生化筛选发现 NF-κB 家族蛋白 p105 和 IκB-α 的锚蛋白重复结构域是 FIH 的直接底物，羟基化发生在连接各个锚蛋白重复序列的发夹环内的特定天冬酰胺残基上。该靶向天冬酰胺位于锚蛋白重复序列共识结构中高度保守的序列内，并且来自许多其他含有锚蛋白重复结构域的蛋白质的肽段在体外支持FIH的催化活性，这表明FIH识别的是锚蛋白重复折叠中共享的广泛结构基序，而非单一的独特序列。这种双重底物特异性（HIF-α的CTAD结构域与NF-κB通路组分、Notch、ASB4和其他蛋白质中发现的锚蛋白重复结构域）使FIH成为缺氧反应与其他信号通路之间潜在的分子串扰点，因为HIF-α和锚蛋白重复结构域底物对有限的FIH酶池的竞争可能使一类底物调节另一类底物的羟基化，进而调控其活性。 FIH的催化活性需要分子氧作为羟基化反应的共底物，这使得FIH介导的HIF及其锚蛋白重复结构域底物的抑制作用直接与细胞氧张力相关。由于FIH的氧敏感性动力学与控制HIF-α稳定性的脯氨酰羟化酶不同，FIH作为第二个生化性质不同的氧感知输入，最终作用于同一HIF转录因子。除了其已知的氧感知功能外，FIH还作为细胞代谢的调节因子。这种代谢调节作用，连同其已知的对血管生成HIF靶基因转录的抑制作用，将FIH活性与代谢紊乱以及缺氧肿瘤微环境中的肿瘤血管生成联系起来。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000-1:5000

反应性

Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

40 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: A20, Lane 2: RAW264.7, Lane 3: C6, Lane 4: PC12