HIP1 Antibody (Rabbit mAb) [B10P18]

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生物描述

特异性 HIP1 Antibody (Rabbit mAb) [B10P18] 可检测内源性 HIP1 总蛋白水平。
背景 HIP1（亨廷顿蛋白相互作用蛋白1）是一种膜相关内吞衔接蛋白，它将网格蛋白包被小窝的动态变化与受体运输、细胞骨架组织和致癌信号传导联系起来，属于从酵母到哺乳动物保守的Sla2/HIP家族网格蛋白-肌动蛋白衔接蛋白。该蛋白包含一个N端ANTH结构域，可结合质膜上的磷脂酰肌醇；一个中央卷曲螺旋区，可与网格蛋白轻链和AP-2结合；以及一个C端类肌动蛋白结构域，具有肌动蛋白结合和推测的死亡效应蛋白同源性。这些结构构成了一个模块化支架，在包被小窝的起始和成熟过程中连接膜、网格蛋白晶格和肌动蛋白丝。 HIP1是新生网格蛋白包被小窝早期募集的辅助因子，在小窝成熟和分裂的后期阶段仍与其保持关联，稳定网格蛋白组装，影响包被小窝的寿命，并协调从扁平网格到深度内陷芽的转变，后者经历动力蛋白依赖性分裂。这些结构和时间特征使HIP1在网格蛋白介导的受体酪氨酸激酶和其他信号受体的内吞作用中处于关键位置。HIP1的缺失或抑制会加速配体诱导的受体（例如EGFR）的内化和降解，而HIP1的过表达则增强受体在质膜上或附近的稳定性，延长PI3K-Akt等信号通路的传导，并促进生长因子依赖性的细胞存活和增殖。 HIP1 也能与亨廷顿蛋白结合，而多聚谷氨酰胺的扩增会降低这种相互作用，这表明 HIP1 可用性的改变以及内吞/细胞骨架功能的变化与亨廷顿病相关的神经退行性变有关。然而，在非神经组织中，HIP1 的过表达表现出转化特性，它与受体信号通路协同作用，驱动非锚定依赖性生长，并参与白血病相关的融合事件，这表明 HIP1 是一种具有内在致癌潜能的内吞蛋白。急性髓系白血病和实体瘤的临床研究报告显示，部分患者存在 HIP1 表达升高，且高水平的 HIP1 转录本与不良的总生存期、特定的突变背景和改变的 microRNA 谱相关。在白血病细胞中，siRNA 介导的 HIP1 敲低会降低细胞增殖，这支持了 HIP1 在肿瘤维持中的功能作用，并提示其可作为依赖持续受体信号通路和内吞重编程的癌症的预后标志物和治疗靶点。 HIP1 是一种磷脂酰肌醇和网格蛋白结合衔接蛋白，它能稳定被膜小窝，将其与肌动蛋白连接，并调节受体内吞作用和运输。HIP1 的表达失调或与亨廷顿蛋白的相互作用受损，会扰乱囊泡动力学，从而导致致癌信号网络和神经退行性机制的改变。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 - 1:10000 1:20 - 1:40 1:100 - 1:250
反应性 Mouse, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 116 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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