HJURP Antibody (Rabbit mAb) [H17B23]

目录号：F6153

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生物描述

特异性 HJURP Antibody (Rabbit mAb) [H17B23] 可检测内源性 HJURP 总蛋白水平。
背景 霍利迪连接识别蛋白（HJURP）是CENP-A的特异性分子伴侣。CENP-A是一种着丝粒特异性组蛋白H3变体，它以表观遗传的方式标记着丝粒染色质，并作为动粒形成的组装平台。HJURP携带一个N端Scm3结构域，该结构域因其与酵母CENP-A伴侣蛋白Scm3的同源性而得名。仅包含该Scm3结构域的HJURP片段就足以在重组系统中特异性地在DNA上组装含CENP-A的核小体。当将该HJURP片段人工连接到非着丝粒染色体位置时，它可以驱动CENP-A在该异位位点沉积，并支持功能性新生动粒的形成。这直接证明了HJURP的Scm3结构域具有内在的催化能力，能够独立于着丝粒的正常基因组环境，催化CENP-A核小体的组装。然而，HJURP 靶向内源性着丝粒依赖于 Mis18 复合物，并且这一着丝粒募集步骤在机制上与染色质组装步骤是可分离的。因为通过人工连接绕过正常的着丝粒靶向，即使在 Mis18 复合物缺失的情况下，CENP-A 的沉积也能进行。这表明 Mis18 控制着 HJURP 的作用位置，而 Scm3 结构域则控制着 HJURP 到达后 CENP-A 的装载方式。此外，HJURP 还通过一个不同于 Scm3 结构域和着丝粒靶向区域的 C 端二聚化结构域进行自缔合。这种二聚化对于 HJURP 在细胞中将 CENP-A 核小体装载到着丝粒 DNA 上至关重要，因为即使保留了着丝粒定位和 CENP-A 结合能力，特异性破坏该二聚化界面的 HJURP 突变体也无法支持正常的 CENP-A 沉积。由于CENP-A和组蛋白H4在核小体形成之前会组装成异二聚体，而一个完整的核小体需要两个CENP-A-H4单元，因此HJURP二聚化被认为能够使两个独立的CENP-A-H4异二聚体彼此靠近，从而为分子伴侣将单独结合的异二聚体转化为八聚体着丝粒核小体提供结构基础。HJURP的募集和CENP-A的沉积仅限于细胞周期的早期G1期，这使得新的着丝粒染色质组装与特定的细胞周期窗口相偶联，而非允许CENP-A的持续掺入。这种细胞周期限制的、依赖于二聚化的、靶向Mis18的机制确保了着丝粒的位置和特性能够忠实地传递给子细胞，并在连续的细胞分裂过程中保持稳定。这种HJURP依赖的CENP-A装载途径的破坏与癌症中非整倍体相关的着丝粒功能障碍和染色体不稳定性有关。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000 1:100
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 84 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: Hela, Lane 2: 293T