HNRNPF Antibody (Mouse mAb) [C13B21]

目录号：F5133

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生物描述

特异性 HNRNPF Antibody (Mouse mAb) [C13B21] 可检测内源性 HNRNPF 总蛋白水平。
背景 HNRNPF是hnRNP F/H家族核RNA结合蛋白中普遍表达的成员，参与早期前体mRNA的加工。它包含三个RNA识别基序，能够结合内含子和3′UTR中的富含G的元件和G-四链体形成序列，从而调控选择性剪接和RNA成熟。串联的RRM结构域能够高亲和力、序列特异性地识别G序列，而柔性连接区和低复杂度区域则支持与RNA和其他剪接因子的多价相互作用，使HNRNPF定位于hnRNP复合物中。这些复合物组装在新生转录本上，并在转录本输出到细胞质之前决定剪接位点的选择。机制研究表明，HNRNPF 增强或抑制外显子包含取决于内含子 G 序列的密度、长度及其与 5′ 剪接位点的接近程度：HNRNPF 结合的 G-四链体形成基序促进盒式外显子的包含，而不同的 G 序列构型则与外显子跳跃相关，这表明局部 RNA 二级结构和 G 序列结构决定了 HNRNPF 在单个外显子上的剪接结果。对少突胶质细胞谱系细胞的全基因组分析表明，hnRNPF 及其旁系同源基因 HNRNPH 调控多种类型的可变剪接事件，并调节约 6% 基因的表达，其中包括少突胶质细胞祖细胞向成熟少突胶质细胞转变的关键调控因子。hnRNPF/H 的缺失会使转录组向分化诱导因子偏移，而远离成熟的负调控因子。在调节性T细胞中，HNRNPF直接与转录因子FOXP3相互作用，该复合物控制参与免疫调节的FOXP3靶基因的选择性剪接；FOXP3-hnRNPF相互作用的紊乱会改变剪接模式并影响Treg细胞的功能，这使得HNRNPF处于免疫稳态转录和转录后调控的交汇点。在胚胎干细胞中，ERK信号通路磷酸化HNRNPF并促进其核活性，从而支持细胞自我更新和增殖，同时通过影响MEK/ERK通路中基因的剪接来抑制分化，该通路将细胞外生长信号与hnRNPF介导的发育基因程序调控联系起来。以癌症为重点的分析表明，HNRNPF 参与 MYC 依赖的剪接调控：hnRNPF 和 hnRNPH 通过与下游富含 G 的顺式元件结合，激活 MYC 调控的 HRAS 盒外显子的插入，而 hnRNPF/H 的缺失会改变前列腺癌细胞的细胞周期进程并诱导其凋亡，这表明 HNRNPF 指导的 HRAS 和其他靶标的剪接有助于致癌信号传导和肿瘤细胞活力。泛癌转录组学研究进一步表明，HNRNPF 与 G2/M 检查点、DNA 修复、IL6/JAK/STAT3 信号传导和有丝分裂纺锤体组织等通路有关，并显示 HNRNPF 表达与免疫细胞浸润相关，且具有肿瘤类型特异性的预后关联，hnRNP 家族表达较高与某些癌症的不良预后相关，而与另一些癌症的良好生存率相关，这与 hnRNPF 调控的剪接在肿瘤生物学和免疫相互作用中发挥的背景依赖性作用相一致。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
WB IF
1:5000-1:50000 1:50-1:500
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 46 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: LNCaP, Lane 2: NIH/3T3, Lane 3: Hela, Lane 4: K562