HOXA10 Antibody (Rabbit mAb) [M2L19]

目录号：F8297

打印

生物描述

特异性 HOXA10 Antibody (Rabbit mAb) [M2L19] 可检测内源性 HOXA10 总蛋白水平。
背景 HOXA10，也称为HOX1H，属于同源异型盒转录因子家族。它能够从众多理论上可结合的DNA序列中选择特定的靶基因，这种选择依赖于与三氨基酸环延伸家族辅助因子（主要是Pbx2和Meis1）的协同作用。因为HOXA10单独存在时靶标特异性有限，而与这些辅助因子形成多聚体复合物则赋予其生理功能所需的增强特异性。在人类子宫内膜中，HOXA10与Pbx2形成异二聚体，该异二聚体直接结合于EMX2基因（一个已验证的HOXA10靶基因）内的增强子元件。该增强子中Pbx结合位点的缺失会消除二聚体的结合，而单独缺失HOXA10结合位点则不会。这表明，即使在名义上由HOXA10识别的位点上，Pbx2与DNA的结合对于稳定该复合物的结构也是必需的。在整个月经周期中，HOXA10、Pbx2 和 Meis1 在子宫内膜间质中共同表达，而 HOXA10 和 Meis1 在腺体中的表达则随周期阶段而变化。这种表达模式以及 EMSA 结合数据表明，异二聚体和三聚体 HOXA10-Pbx2-Meis1 复合物，而非 HOXA10 单独作用，决定了子宫内膜容受期内哪些靶基因被激活。HOXA10 及其旁系同源物 HOXA11 通过基质金属蛋白酶调节细胞外基质重塑、包括白血病抑制因子在内的细胞因子信号传导以及 β-3 整合素等细胞黏附分子来调控子宫内膜容受性。这些下游效应因子共同驱动上皮细胞和间质细胞分化以及滋养层细胞侵袭能力，而这些是胚胎着床所必需的。 HOXA10 和 HOXA11 的表达本身受雌激素和孕激素的动态调控，在月经周期的分泌期（即胚胎着床期）达到峰值。这种激素和转录程序的紊乱会导致特定的疾病后果：子宫内膜异位症中 HOXA10 表达降低是由于 DNA 高甲基化和慢性炎症所致，从而破坏着床部位的免疫调节和细胞因子信号传导；而子宫腺肌症中 HOXA11 调控的细胞外基质重塑和 β3 整合素表达则分别受到干扰，通过一种机制不同的途径损害胚胎着床。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM, ChIP 稀释比例
WB IP IF FCM ChIP
1:1000 1:30 1:50 1:50 1:100
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 42 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: THP-1, Lane 2: 293T