HOXA9 Antibody (Rabbit mAb) [A6N14] Datasheet

生物描述

特异性	HOXA9 Antibody (Rabbit mAb) [A6N14] 可检测内源性 HOXA9 总蛋白水平。
背景	HOXA9 是一种同源异型盒家族转录因子，其包含一个保守的同源异型结构域，用于序列特异性 DNA 结合。HOXA9 在造血干细胞和祖细胞中高表达，调控支持干细胞扩增、谱系定向和早期血细胞发育的基因表达程序。该蛋白在 HOX 簇内发挥作用，并与 TALE 辅助因子（如 PBX 和 MEIS）形成协同复合物。它利用其同源异型结构域及其侧翼区域结合调控元件，从而控制广泛的转录网络，该网络包括参与自我更新、存活、黏附和细胞因子信号传导的基因。随着祖细胞分化为成熟的造血谱系，HOXA9 的表达逐渐降低。在人类胚胎干细胞分化过程中，HOXA9 的表达与造血进程平行，且仅限于造血前体细胞。功能获得和功能丧失研究表明，HOXA9 可促进这些前体细胞分化为原始和总的 CD45 阳性血细胞，部分是通过与 NF-κB 信号通路协同作用实现的，这表明 HOXA9 将发育信号与早期造血细胞分化的转录调控整合在一起。在白血病中，HOXA9 的表达经常失调，尤其是在伴有 MLL 重排和其他上游病变的急性髓系白血病中。HOXA9 的持续表达维持着多种抗凋亡通路和生长程序的基因表达；髓系祖细胞中 HOXA9 的过表达可维持干细胞样转录状态，而与 MEIS1 或 PBX1 的联合表达则可驱动完全的白血病转化，从而确立了 HOXA9 作为白血病基因表达的核心效应因子的地位。从机制上讲，HOXA9通过结合非编码调控序列并募集C/EBPα和MLL3/MLL4甲基转移酶复合物，重编程髓系和B细胞祖细胞中的增强子图谱，从而导致白血病特异性增强子的形成、异位胚胎基因程序的激活以及干性和生存基因的维持，这些基因支持恶性进展。对人造血细胞的转录组分析表明，HOXA9的过表达上调了与干细胞维持、细胞周期进程和抗凋亡相关的基因簇，而HOXA9的缺失则损害正常的造血发育并降低再生能力，这证实了HOXA9的双重作用：既是生理干细胞功能的正向调节因子，也是白血病发生的驱动因子。在实体瘤中，HOXA9在多种癌症类型中异常表达，并通过PBX/MEIS介导的与这些通路组分的启动子和增强子的结合，作为EMT、自噬、细胞周期、代谢和主要信号通路（包括Wnt、TGF-β、PI3K/AKT、AMPK和NF-κB）的转录调控因子发挥作用。泛癌分析表明，HOXA9的表达模式具有诊断和预后意义，与肿瘤分期和免疫浸润相关。因此，在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中，HOXA9作为一种模块化转录因子，其基于同源域的DNA结合和辅助因子相互作用能够重塑增强子和启动子图谱，维持抗凋亡和干性相关基因的表达，并将发育信号通路与致癌程序相偶联。

特异性

HOXA9 Antibody (Rabbit mAb) [A6N14] 可检测内源性 HOXA9 总蛋白水平。

背景

HOXA9 是一种同源异型盒家族转录因子，其包含一个保守的同源异型结构域，用于序列特异性 DNA 结合。HOXA9 在造血干细胞和祖细胞中高表达，调控支持干细胞扩增、谱系定向和早期血细胞发育的基因表达程序。该蛋白在 HOX 簇内发挥作用，并与 TALE 辅助因子（如 PBX 和 MEIS）形成协同复合物。它利用其同源异型结构域及其侧翼区域结合调控元件，从而控制广泛的转录网络，该网络包括参与自我更新、存活、黏附和细胞因子信号传导的基因。随着祖细胞分化为成熟的造血谱系，HOXA9 的表达逐渐降低。在人类胚胎干细胞分化过程中，HOXA9 的表达与造血进程平行，且仅限于造血前体细胞。功能获得和功能丧失研究表明，HOXA9 可促进这些前体细胞分化为原始和总的 CD45 阳性血细胞，部分是通过与 NF-κB 信号通路协同作用实现的，这表明 HOXA9 将发育信号与早期造血细胞分化的转录调控整合在一起。在白血病中，HOXA9 的表达经常失调，尤其是在伴有 MLL 重排和其他上游病变的急性髓系白血病中。HOXA9 的持续表达维持着多种抗凋亡通路和生长程序的基因表达；髓系祖细胞中 HOXA9 的过表达可维持干细胞样转录状态，而与 MEIS1 或 PBX1 的联合表达则可驱动完全的白血病转化，从而确立了 HOXA9 作为白血病基因表达的核心效应因子的地位。从机制上讲，HOXA9通过结合非编码调控序列并募集C/EBPα和MLL3/MLL4甲基转移酶复合物，重编程髓系和B细胞祖细胞中的增强子图谱，从而导致白血病特异性增强子的形成、异位胚胎基因程序的激活以及干性和生存基因的维持，这些基因支持恶性进展。对人造血细胞的转录组分析表明，HOXA9的过表达上调了与干细胞维持、细胞周期进程和抗凋亡相关的基因簇，而HOXA9的缺失则损害正常的造血发育并降低再生能力，这证实了HOXA9的双重作用：既是生理干细胞功能的正向调节因子，也是白血病发生的驱动因子。在实体瘤中，HOXA9在多种癌症类型中异常表达，并通过PBX/MEIS介导的与这些通路组分的启动子和增强子的结合，作为EMT、自噬、细胞周期、代谢和主要信号通路（包括Wnt、TGF-β、PI3K/AKT、AMPK和NF-κB）的转录调控因子发挥作用。泛癌分析表明，HOXA9的表达模式具有诊断和预后意义，与肿瘤分期和免疫浸润相关。因此，在血液系统恶性肿瘤和实体瘤中，HOXA9作为一种模块化转录因子，其基于同源域的DNA结合和辅助因子相互作用能够重塑增强子和启动子图谱，维持抗凋亡和干性相关基因的表达，并将发育信号通路与致癌程序相偶联。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000 - 1:10000	1:200

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

30 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: HepG2, Lane 2: U937, Lane 3: SW480, Lane 4: 293T