HRPT2/Parafibromin Antibody (Rabbit mAb) [E14N24]

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生物描述

特异性 HRPT2/Parafibromin Antibody (Rabbit mAb) [E14N24] 可检测内源性 HRPT2/Parafibromin 总蛋白水平。
背景 副纤维蛋白（Parafibromin）是HRPT2/CDC73肿瘤抑制基因的蛋白产物，是人类PAF1复合物中进化保守的组成部分。该复合物将RNA聚合酶II的转录延伸和3′末端加工与染色质修饰以及原癌基因和细胞周期促进转录程序的抑制联系起来。副纤维蛋白主要定位于细胞核，并通过其C端区域与酵母Paf1复合物亚基的人类同源物（包括PAF1、LEO1、CTR9和SKI8）结合。该C端区域常因生殖系和体细胞HRPT2突变而发生截短或缺失；该C端结构域对于与RNA聚合酶II CTD的Ser2和Ser5磷酸化形式稳定相互作用至关重要，并将副纤维蛋白定位在延伸的转录复合物中，从而协调RNA加工因子和染色质调节因子的募集。作为 PAF1 复合物的一部分，副纤维蛋白参与将转录延伸与组蛋白 H2B 单泛素化和组蛋白 H3 赖氨酸 4 和 79 甲基化偶联，此外，它还招募或与组蛋白修饰酶合作，在特定的生长调节位点建立抑制性染色质：副纤维蛋白促进细胞周期蛋白 D1/CCND1 启动子处组蛋白 H3 赖氨酸 9 甲基化和 H3 乙酰化减少，它还有助于抑制 c-MYC 原癌基因，为其抗增殖活性提供了直接的机制基础。 RNA干扰对副纤维蛋白的功能破坏会加速S期细胞的进入并增加细胞周期蛋白D1的表达；而野生型（而非癌症相关突变型）副纤维蛋白的瞬时过表达则会抑制细胞增殖并抑制细胞周期蛋白D1的表达，这表明完整的HRPT2/CDC73-PAF1相互作用和副纤维蛋白依赖的染色质重塑与G1/S期进程的抑制有关。副纤维蛋白还将经典的Wnt/β-catenin信号通路与转录输出整合起来：去磷酸化的副纤维蛋白与β-catenin结合，并结合TCF/LEF反应性启动子，作为Wnt靶基因（如c-MYC、细胞周期蛋白D1和AXIN2）的转录共激活因子；而磷酸化的副纤维蛋白则倾向于形成抑制性复合物，这表明其磷酸化状态决定了在共享的生长调控位点上，肿瘤抑制性抑制和依赖于特定环境的Wnt共激活之间的转换。 c-MYC 和 CCND1 的双重作用表明，副纤维蛋白并非简单地全局性地沉默增殖基因，而是通过启动子和通路特异性的染色质机制来调控它们的表达，这些机制对上游形态发生素的输入十分敏感。HRPT2/CDC73 的种系失活是甲状旁腺功能亢进-颌骨肿瘤综合征的病因，并且与甲状旁腺癌密切相关；而体细胞突变和副纤维蛋白表达缺失则发生于散发性甲状旁腺癌以及其他一些内分泌和非内分泌肿瘤中；副纤维蛋白免疫阴性可作为区分良恶性甲状旁腺肿瘤的诊断标志物。除了甲状旁腺组织外，副纤维蛋白表达失调和 CDC73 转录改变（包括 Wilms 肿瘤抑制因子 WT1 的抑制）将该因子与更广泛的致癌环境联系起来；新出现的数据表明，副纤维蛋白-PAF1 复合物与白血病 MLL 融合转录程序以及病毒宿主相互作用有关。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, FCM 稀释比例
WB IHC FCM
1:1000 1:1000 1:500
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 61 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: HeLa, Lane 2: Caco-2, Lane 3: HepG2