IFITM1 Antibody (Rabbit mAb) [E10P18]

目录号：F6102

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生物描述

特异性 IFITM1 Antibody (Rabbit mAb) [E10P18] 可检测内源性 IFITM1 总蛋白水平。
背景 IFITM1是干扰素诱导跨膜蛋白（IFITM）家族的成员，该家族编码小型CD225超家族膜蛋白，其N端和C端区域较短，包含两个疏水区段（TM1和TM2），这两个疏水区段可作为膜内或跨膜结构域发挥作用，并具有一个保守的胞质环。IFITM1广泛表达于多种组织的质膜和内溶酶体区室，并作为先天性抗病毒程序的一部分，受到I型和II型干扰素的强烈上调。保守的TM1和胞质结构域支持膜结合和家族范围内的功能。与IFITM2/3不同的是，IFITM1的亚细胞分布主要位于细胞表面和早期内吞囊泡，这与其限制在质膜或附近而非内体网络深处融合的病毒的作用相一致。从机制上讲，IFITM1及其相关IFITM蛋白作为细胞自主性抗病毒因子，允许病毒内吞，但通过改变脂质组成、降低膜流动性和改变膜曲率，阻断病毒包膜与宿主内体或溶酶体膜的半融合和完全融合，从而在复制周期的早期阶段阻止病毒核心释放到胞质溶胶中。功能研究表明，IFITM1限制多种包膜病毒的入侵，包括甲型流感病毒、SARS-CoV和SARS-CoV-2、马尔堡病毒和埃博拉病毒丝状病毒、登革热病毒和西尼罗河病毒黄病毒、HIV-1和丙型肝炎病毒，并能抑制流感病毒的血凝素介导入侵和冠状病毒的刺突蛋白介导入侵。这表明IFITM1是病原体在细胞表面或早期内体中通过pH依赖性或pH非依赖性融合途径入侵的重要广谱屏障。除了直接限制病毒入侵外，IFITM1 还参与干扰素和固有免疫信号通路：I 型和 II 型干扰素可强烈诱导其转录，IFITM1 通过抑制 ERK 激活或诱导 p53 依赖的 G1 期细胞周期阻滞，促进干扰素-γ 介导的抗增殖效应，从而将抗病毒防御与细胞周期调控和组织重塑联系起来。IFITM1 也影响适应性免疫；IFITM1-3 在 T 细胞中表达，并以 T 细胞自身的方式调节 CD4 辅助性 T 细胞的分化，因此 IFITM1 的表达状态可以影响效应 T 细胞与调节性 T 细胞的平衡，进而影响慢性感染和自身免疫性疾病的发生发展。在肝细胞中，IFITM1 与 IFITM2 和 IFITM3 协同作用，通过引导内吞的病毒颗粒进行溶酶体降解来限制 HCV 感染。其中，IFITM1 主要影响病毒的早期进入步骤，而 IFITM2/3 则通过将病毒颗粒捕获在内体系统中来补充这一作用，这表明 IFITM 家族内部存在亚型特异性但协同的抗病毒机制。已有报道称，IFITM1 的表达失调与多种癌症相关，包括炎性乳腺癌。在炎性乳腺癌中，IFITM1 的上调与肿瘤的侵袭性行为相关。功能实验表明，IFITM1 参与干扰素-γ 下游的细胞黏附、迁移和生长调控，提示在肿瘤微环境中，IFITM1 的膜重塑和信号传导功能可能被肿瘤细胞利用，从而促进肿瘤侵袭和治疗耐药。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IP IHC IF FCM
1:2000 1:30 1:2000 1:500 1:500
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 14 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: K562, Lane 2: HeLa, Lane 3: TF-1