IL-6 Antibody [L17N21]

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生物描述

特异性 IL-6 Antibody [L17N21] 可检测内源性 IL-6 总蛋白水平。
背景 白细胞介素-6 (IL-6) 属于IL-6细胞因子家族，该家族成员均以gp130作为共同的信号转导受体亚基。该蛋白呈四螺旋束结构，拓扑结构为上-上-下-下，其中螺旋A-D通过环状结构连接，CD环中包含一个微螺旋；185个氨基酸残基中有157个排列有序，而N端（残基1-18）和A-B环部分则保持无序状态。 IL-6 首先与 IL-6Rα 结合，其胞外区包含三个结构域：N 端 Ig 样结构域 D1（氨基酸残基 1-93），通过二硫键（D2 中的 C6-C174）与细胞因子结合；细胞因子结合结构域 D2（氨基酸残基 94-194）；以及形成纤连蛋白 III 型模块的 D3（氨基酸残基 195-299），该模块具有 WSXWS 基序（氨基酸残基 284-287）。IL-6 与 IL-6Rα 结合发生在 D2-D3 连接处，通过氨基酸残基 P162、E163（L3）、S228、F229、Y230、R231（L5）、E278 和 F279（L7）相互作用，从而实现受体头尾二聚化，并通过疏水相互作用（如 F134 和 F168）进行连接。 IL-6/IL-6Rα异二聚体募集gp130，其膜远端Ig样D1结构域和细胞因子结合D2-D3结构域与IL-6的II和III结合位点相互作用，形成2:2:2六聚体复合物，该复合物可使gp130二聚化以进行信号传导。IL-6由T细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞产生，它通过促使肝细胞生成C反应蛋白和急性期蛋白来启动急性期反应。IL-6促进B细胞分化为浆细胞，促进胸腺细胞和T细胞增殖，并与TGF-β共同促进Th17细胞发育。[用户提供] gp130二聚化激活JAK/STAT（主要是STAT3）、SHP-2/ERK MAPK和PI3K通路，从而驱动炎症、造血和免疫调节相关基因的表达。可溶性IL-6Rα促进缺乏膜IL-6Rα的gp130阳性细胞的跨膜信号传导，从而在炎症条件下增强其对内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌的作用。IL-6水平升高促进肿瘤生长、VEGF介导的血管生成和转移，尤其是在乳腺癌中。信号传导失调是类风湿性关节炎、多发性骨髓瘤、前列腺癌、绝经后骨质疏松症和心血管炎症的病理基础。

使用信息

抗体应用 WB, IP 稀释比例
WB IP
1:1000 1:100
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 21-28 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Recombinant Human Interleukin-6