Ionotropic Glutamate receptor 2 Antibody [P18H1]

目录号：F4840

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生物描述

特异性 Ionotropic Glutamate receptor 2 Antibody [P18H1] 可检测内源性 Ionotropic Glutamate receptor 2 总蛋白水平。
背景 离子型谷氨酸受体2 (GluR2) 是AMPA受体 (AMPAR) 的关键亚基，AMPA受体在中枢神经系统（尤其是海马和皮层）中构成快速兴奋性阳离子通道。GluR2赋予异源四聚体GluR1-4组装体Ca²⁺不通透性和快速脱敏能力，这对于突触可塑性至关重要。GluR2具有一个N端配体结合域 (LBD)，该结构具有蛤壳状S1S2双叶折叠，在谷氨酸结合后闭合约20°；三个跨膜螺旋 (M1、M3、M4) 与一个M2重入环共同构成中央孔；M2处的Q/R位点（由ADAR2介导的RNA编辑导致Gln607→Arg607）可阻止Ca²⁺的渗透。 P_x_x_G 翻转/折叠剪接位点调节脱敏，而短的 C 端尾部结合 NSF、PICK1 和 4.1N 以调节突触运输。GluR2 主导的 AMPAR，主要是 GluR2/GluR3 异源二聚体（约占突触的 70%），介导半峰宽为 1–5 ms、幅度为 10–100 pA 的快速 EPSC，具有较低的单通道电导（约 8 pS），并且由于多胺阻滞作用，在 +40 mV 时表现出内向整流特性。与未编辑的 GluR2(Q) 相比，Q/R 编辑显著降低了 Ca²⁺ 通透性（P_Ca/P_Na < 0.1）（约降低 10%）。活性依赖性转运，例如CaMKII在S831位点的磷酸化导致GluR1/2插入，以及PKA在S845位点的磷酸化促进表面稳定，是长时程增强（LTP）的基础，可使AMPA受体增加高达三倍。GluR2对于突触成熟（高频刺激后沉默突触获得GluR2）、空间记忆（GluR2敲除会损害Morris水迷宫实验表现）和神经保护（未编辑的GluR2会导致运动神经元死亡）至关重要。GluR2还通过PSD-95与NMDA受体相互作用，实现协同检测。ADAR2下调导致未编辑的GluR2，从而引起肌萎缩侧索硬化症（ALS）和运动神经元疾病中的Ca²⁺超载和兴奋性毒性，而缺乏GluR2的AMPA受体则与癫痫有关。 GluR2拮抗剂通过降低突触后兴奋性来治疗难治性癫痫。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:2000 1:40 1:500
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 98 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain, Lane 3: Human fetal brain