JAK3 Antibody [F8D8] Datasheet

生物描述

特异性	JAK3 Antibody [F8D8] 可检测内源性 JAK3 总蛋白水平。
背景	JAK3（Janus激酶3）是Janus激酶（JAK）家族的非受体酪氨酸激酶成员，该家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，主要在造血细胞中表达，在那里它特异性地与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21细胞因子受体的共同γ链（γc）结合。 JAK3 具有保守的多结构域组织，包括一个用于受体结合的 N 端 FERM 结构域、一个 SH2 样结构域、一个缺乏内在催化活性但负调控相邻活性激酶结构域 (JH1) 的假激酶结构域 (JH2) 以及一个具有双叶结构的 C 端 JH1 激酶结构域，其特征在于一个 β 折叠的 N 叶、一个 αC 螺旋和一个含有插入的 αFG 螺旋（氨基酸残基 1029–1038）的 C 叶；调控性磷酸化位点包括 JH1 激活环中的 Tyr980 和 Tyr981。细胞因子诱导的受体二聚化触发 JAK3 的自身磷酸化以及与 JAK1 或 JAK2 的反式磷酸化，从而激活 JH1 结构域磷酸化受体酪氨酸残基，这些酪氨酸残基通过 SH2 结构域作为 STAT 蛋白（例如 STAT5）的结合位点。 STAT 的后续激活促进对免疫细胞增殖、分化、存活和发育至关重要的基因转录，尤其是在 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞中。JAK-STAT 通路对于淋巴细胞生成和适应性免疫至关重要，其中 JH2 假激酶结构域通过变构作用抑制 JH1 的活性，直至配体结合。JAK3 的失调，包括功能获得性突变（通常发生在 JH2 中），会导致持续的信号传导和白血病及淋巴瘤的发生，而功能丧失性突变则会导致重症联合免疫缺陷 (SCID)。

特异性

JAK3 Antibody [F8D8] 可检测内源性 JAK3 总蛋白水平。

背景

JAK3（Janus激酶3）是Janus激酶（JAK）家族的非受体酪氨酸激酶成员，该家族包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，主要在造血细胞中表达，在那里它特异性地与IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21细胞因子受体的共同γ链（γc）结合。 JAK3 具有保守的多结构域组织，包括一个用于受体结合的 N 端 FERM 结构域、一个 SH2 样结构域、一个缺乏内在催化活性但负调控相邻活性激酶结构域 (JH1) 的假激酶结构域 (JH2) 以及一个具有双叶结构的 C 端 JH1 激酶结构域，其特征在于一个 β 折叠的 N 叶、一个 αC 螺旋和一个含有插入的 αFG 螺旋（氨基酸残基 1029–1038）的 C 叶；调控性磷酸化位点包括 JH1 激活环中的 Tyr980 和 Tyr981。细胞因子诱导的受体二聚化触发 JAK3 的自身磷酸化以及与 JAK1 或 JAK2 的反式磷酸化，从而激活 JH1 结构域磷酸化受体酪氨酸残基，这些酪氨酸残基通过 SH2 结构域作为 STAT 蛋白（例如 STAT5）的结合位点。 STAT 的后续激活促进对免疫细胞增殖、分化、存活和发育至关重要的基因转录，尤其是在 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞中。JAK-STAT 通路对于淋巴细胞生成和适应性免疫至关重要，其中 JH2 假激酶结构域通过变构作用抑制 JH1 的活性，直至配体结合。JAK3 的失调，包括功能获得性突变（通常发生在 JH2 中），会导致持续的信号传导和白血病及淋巴瘤的发生，而功能丧失性突变则会导致重症联合免疫缺陷 (SCID)。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:100

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

115 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: NK-92, Lane 2: Jurkat, Lane 3: SET-2, Lane 4: KARPAS-299