JNK1 + JNK2 + JNK3 Antibody (Rabbit mAb) [G2M15]

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生物描述

特异性 JNK1 + JNK2 + JNK3 Antibody (Rabbit mAb) [G2M15] 可检测内源性 JNK1, JNK2 和 JNK3 总蛋白水平。
背景 JNK1、JNK2 和 JNK3 属于丝裂原激活蛋白激酶家族的应激激活分支，存在多种剪接变体，JNK1 和 JNK2 各有 4 种，JNK3 有 2 种，其中 JNK1 和 JNK2 广泛表达，而 JNK3 的表达主要局限于大脑、心脏组织和睾丸。这三种亚型都需要在其激活环内保守的苏氨酸-脯氨酸-酪氨酸基序上进行双重磷酸化才能被激活，这种磷酸化是由两个上游双特异性激酶 MKK4 和 MKK7 完成的，它们表现出不同的底物偏好：MKK4 优先磷酸化 JNK 的酪氨酸，而 MKK7 优先磷酸化 JNK 的苏氨酸，MKK7 单独磷酸化苏氨酸只能产生部分 JNK 激活，最大活性需要两种激酶共同作用于 TPY 基序的两个残基。 MKK4 和 MKK7 本身受不同的细胞外刺激激活，其中 MKK7 是响应促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-1 而激活 JNK 所必需的，这表明 MKK7 是该通路细胞因子反应分支中一个必不可少的、不可或缺的组成部分，尽管 MKK4 和 MKK7 在体外直接测试时都能激活 JNK。由于 MKK4 和 MKK7 也是其他 MAP 激酶通路的上游激活因子，因此通路特异性是通过 JIP 家族的支架蛋白 JIP1、JIP2 和 JIP3 来维持的，这些支架蛋白将上游 MAP3K（例如 MLK3）、一个或两个 MKK 以及特定的 JNK 亚型的特定组合物理连接成一个单一的信号模块；重组实验表明，JIP1 和 JIP2 与相应的 JNK 亚型共表达时，能显著增强 MLK3 驱动的 JNK 激活，这直接证明了支架蛋白的组装，而非激酶浓度本身，决定了该级联反应中信号的有效传递。JNK 激活后，会磷酸化 c-Jun，驱动 AP-1 依赖性转录，并直接磷酸化和激活促凋亡的 Bcl-2 家族成员 Bax、Bid 和 Bim，从而触发细胞色素 c 和 Smac/Diablo 从线粒体释放，并通过凋亡体激活 caspase。这表明，在细胞应激条件下，JNK 驱动的细胞凋亡是持续激酶激活的明确下游结果。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:1000 1:40 1:1000 1:100
反应性 Mouse, Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 48 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: Jurkat, Lane 2: Hela, Lane 3: RAW 264.7, Lane 4: PC12