K48-linkage Specific Polyubiquitin Antibody [B3A13] Datasheet

生物描述

特异性	K48-linkage Specific Polyubiquitin Antibody [B3A13] 可检测由 Lys48 残基连接形成的内源性总多聚泛素链水平。
背景	K48连接特异性多聚泛素是一种特殊的多聚泛素链，其中泛素分子通过赖氨酸48残基连接，主要作为信号分子，引导蛋白质靶向26S蛋白酶体进行降解，从而调控蛋白质周转和细胞稳态。在生理条件下，K48连接的多聚泛素链呈现紧凑的“闭合”构象，这种构象是由泛素-泛素界面上的关键泛素残基（如Leu8、Ile44和Val70）之间的疏水相互作用介导的，从而促进蛋白酶体和泛素受体的有效识别。这些链通过标记受损、错误折叠或不需要的蛋白质进行蛋白酶体降解，在控制蛋白质质量方面发挥着重要作用，这对于细胞周期进程、应激反应和细胞凋亡等过程至关重要。最近的研究表明，K48连接的泛素链具有非蛋白水解功能，包括作为转录因子的“活性开关”，并通过与分支状K63连接相互作用来调节NF-κB等信号通路。在DNA损伤反应中，K48多聚泛素化会引导特定蛋白质降解，从而促进DNA修复。这些泛素链的动态组装和识别对于维持细胞蛋白质稳态和预防包括癌症和神经退行性疾病在内的病理状态至关重要。

特异性

K48-linkage Specific Polyubiquitin Antibody [B3A13] 可检测由 Lys48 残基连接形成的内源性总多聚泛素链水平。

背景

K48连接特异性多聚泛素是一种特殊的多聚泛素链，其中泛素分子通过赖氨酸48残基连接，主要作为信号分子，引导蛋白质靶向26S蛋白酶体进行降解，从而调控蛋白质周转和细胞稳态。在生理条件下，K48连接的多聚泛素链呈现紧凑的“闭合”构象，这种构象是由泛素-泛素界面上的关键泛素残基（如Leu8、Ile44和Val70）之间的疏水相互作用介导的，从而促进蛋白酶体和泛素受体的有效识别。这些链通过标记受损、错误折叠或不需要的蛋白质进行蛋白酶体降解，在控制蛋白质质量方面发挥着重要作用，这对于细胞周期进程、应激反应和细胞凋亡等过程至关重要。最近的研究表明，K48连接的泛素链具有非蛋白水解功能，包括作为转录因子的“活性开关”，并通过与分支状K63连接相互作用来调节NF-κB等信号通路。在DNA损伤反应中，K48多聚泛素化会引导特定蛋白质降解，从而促进DNA修复。这些泛素链的动态组装和识别对于维持细胞蛋白质稳态和预防包括癌症和神经退行性疾病在内的病理状态至关重要。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

All Species Expected

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的组织裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。 PVDF 膜孔径规格选择参照表

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: H1703, Lane 2: H1703 (MG132-treated)