Kindlin-3 Antibody (Rabbit mAb) [B13M6]

目录号：F6632

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生物描述

特异性 Kindlin-3 Antibody (Rabbit mAb) [B13M6] 可检测内源性 Kindlin-3 总蛋白水平。
背景 Kindlin-3 属于 Kindlin 家族的 FERM 结构域黏着斑衔接蛋白，在三个哺乳动物旁系同源蛋白中，其表达仅限于造血谱系，这使其区别于表达更广泛的 Kindlin-1 和 Kindlin-2。Kindlin-3 与 β 整合素亚基的胞质尾结合，并与 Talin-1 协同作用驱动整合素激活，但这两个衔接蛋白在此过程中发挥着不同的作用。Talin-1 与 β2 整合素尾的结合驱动整合素胞外结构域的延伸和头部结构的开放，使受体从弯曲的低亲和力构象转变为能够与配体结合的伸展构象。Kindlin-3 作用于另一个结构元件，破坏整合素 α 和 β 胞质尾之间靠近细胞膜的结合，这种结合通常将受体维持在非活性状态。该夹子的释放使得胞外结构域得以展开，并使受体做好与高亲和力配体结合的准备。胞外结构域与配体结合（例如，LFA-1 通过与 ICAM-1 相互作用）会触发 β2 尾部膜近端区域与 kindlin-3 的 N 端区域之间的瞬时结合。这种配体诱导的 α/β 夹子解离先于并促成了 talin-1 与 β2 尾部的稳定、高亲和力结合。这一步骤还需要 talin 杆状结构域和完整的肌动蛋白细胞骨架。该序列建立了一个正反馈回路，其中 kindlin-3 和 talin-1 交替增强整合素的激活，这种增强由 GTPase Rap1 介导的由内而外的信号传导以及配体结合的高亲和力整合素构象体积累后产生的由外而内的信号传导协调。机械剪切力进一步稳定了这种活性状态，并增强了两种衔接蛋白与受体的结合。在迁移的淋巴细胞中，kindlin-3 和 talin-1 呈不对称分布，追踪整合素亲和力从前缘到黏附细胞体的空间成熟过程，并将这种激活级联与流动条件下的定向迁移和牢固黏附联系起来。FERMT3 基因的功能缺失突变会消除血小板和白细胞中这种整合素激活功能，导致白细胞黏附缺陷 III 型，这是一种以血小板聚集缺陷和白细胞在炎症部位的滞留和跨内皮迁移受损为特征的疾病，强调了整合素依赖性黏附中两种衔接蛋白不可或缺的组合作用。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, FCM 稀释比例
WB IP IHC FCM
1:1000 1:100 1:400 1:50
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 75 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: J774A.1