Laminin Antibody (Mouse mAb) [E12M18]

目录号：F3833

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生物描述

特异性

Laminin Antibody (Mouse mAb) [E12M18] 可检测内源性 Laminin 总蛋白水平。
背景

层粘连蛋白是由α、β和γ链组装而成的异源三聚体细胞外基质糖蛋白，这些链通过卷曲螺旋结构域结合形成十字形分子。其短臂介导自身聚合，长臂则带有LG结构域，可与细胞表面受体结合。层粘连蛋白的聚合始于三个独立三聚体短臂之间的相互作用，主要由α链的LN结构域驱动，从而形成一个新生的二维晶格并锚定于细胞表面。这种细胞表面锚定需要通过层粘连蛋白的LG结构域与两类主要受体——整合素和肌营养不良蛋白聚糖——结合。这两种受体以部分补偿的方式发挥作用：单独使用任一受体均可支持层粘连蛋白的募集和基底膜的形成，但当两种受体同时结合时，效率和下游细胞极化作用达到最大值；而当两种受体均缺失时，层粘连蛋白的积累将完全消失，并诱导受影响细胞的凋亡。一旦锚定，新生的层粘连蛋白支架会募集巢蛋白、IV型胶原蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（包括perlecan和agrin）。巢蛋白在层粘连蛋白和独立自组装的IV型胶原蛋白网络之间形成桥接，这两个聚合物系统共同构成成熟基底膜的结构核心。整合素和肌营养不良蛋白聚糖的参与进一步将组装好的基质与下方的肌动蛋白和角蛋白细胞骨架连接起来，在细胞表面双向传递机械和信号信息，并影响细胞的形状、极性、黏附和分化。层粘连蛋白的亚型组成因组织和发育阶段而异，不同的α、β和γ链组合定义了上皮组织、血管组织、神经组织和肌肉组织的基底膜。影响 α2 层粘连蛋白链或其肌营养不良蛋白聚糖和整合素受体相互作用的突变会破坏骨骼肌的肌膜晶格组织，是先天性肌营养不良症的公认病因。

使用信息

抗体应用 IHC, IF, ELISA 稀释比例
IHC
1:25
反应性 Feline, Human, Porcine
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 337 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IHC

Validated by Selleck

  • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded human oral tumors tissue with F3833 at 1:25 dilution.