LAMTOR5/HBXIP Antibody [L8H1]

目录号：F8719

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生物描述

特异性 LAMTOR5/HBXIP Antibody [L8H1] 可检测内源性 LAMTOR5/HBXIP 总蛋白水平。
背景 LAMTOR5，又名HBXIP，是Ragulator复合物的第五个亚基。Ragulator复合物是由LAMTOR1、LAMTOR2、LAMTOR3和LAMTOR4组成的五聚体复合物，存在于晚期内体和溶酶体表面。LAMTOR5蛋白包含一个Roadblock结构域（氨基酸残基1-161），该结构域对于通过α螺旋界面形成异源六聚体至关重要，并通过N-糖基化和脂质相互作用将复合物锚定在溶酶体膜上。LAMTOR5通过其C端的疏水相互作用与LAMTOR2和LAMTOR4结合，稳定支架结构并暴露Rag结合位点。 Ragulator复合物将Rag GTP酶（RagA/B至RagC/D异二聚体）募集至溶酶体。在溶酶体中，v-ATPase质子梯度介导的氨基酸感知使Rag从GDP结合（非活性）状态转变为GTP结合（活性）状态。活性Rag随后将mTORC1（包括mTOR、Raptor和Rictor）锚定于溶酶体表面，使Rheb-GTP能够激活mTOR激酶。这种激活驱动合成代谢信号通路，包括核糖体生物合成、通过S6K1和4E-BP1磷酸化进行的蛋白质合成以及脂质代谢。在营养丰富的条件下，该通路促进细胞生长；在饥饿条件下，该通路的破坏会通过ULK1激活触发自噬。 LAMTOR5对复合物的完整性至关重要，其敲除表型与LAMTOR3或LAMTOR4缺失表型相似，会损害mTORC1的溶酶体募集以及下游S6K和4E-BP1的磷酸化。HBXIP与survivin相互作用以抑制caspase激活和细胞凋亡，与微管和中心体结合以促进纺锤体组装，并作为转录共激活因子与c-MYB、SP1、CREB、TBP和E2F1共同驱动增殖相关基因的表达。LAMTOR5是上胚层分化和器官发生所必需的；缺乏Hbxip的胚胎由于mTORC1活性降低而停滞在E8.5，并出现外胚层和中胚层发育缺陷。在疾病中，HBXIP 在乳腺癌、结肠癌和胶质瘤等癌症中的过度表达通过激活 mTORC1 和 NF-κB/PPARδ 信号环路增强迁移、侵袭和不良预后。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:1000 1:50 1:800
反应性 Human, Mouse, Rat, Monkey
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 10.5 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。 (建议曝光时长 120s 以上)
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: Hela, Lane 2: C6, Lane 3: COS-7, Lane 4: Vero