Lin28B Antibody (Rabbit mAb) [J18A6]

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生物描述

特异性 Lin28B Antibody (Rabbit mAb) [J18A6] 可检测内源性 Lin28B 总蛋白水平。
背景 LIN28B 是 Lin28 家族中进化保守的 RNA 结合蛋白，它包含一个 N 端冷休克结构域和一对 C 端 CCHC 锌指基序，它作为转录后调节因子，抑制抑癌 let-7 微 RNA 家族的成熟，同时结合和调节其他含有 GGAG 的前体 miRNA，以控制发育时间、干性和致癌信号传导。冷休克结构域和锌指结构域协同作用，识别前体let-7及其相关前体miRNA末端环中的5′‐GGAG‐3′基序，形成稳定的复合物，阻断Dicer酶的加工，并在许多情况下募集末端尿苷酰转移酶（如ZCCHC11/TUT4）催化这些前体的3′尿苷酰化及其后续降解，从而降低成熟let-7的水平，并解除对let-7靶mRNA（包括RAS、MYC和HMGA2）的抑制。LIN28B还能结合初级let-7转录本，并将初级let-7隔离在核仁区室中，使其远离微处理器复合物，从而为let-7的生物合成提供额外的上游检查点，并增强发育组织和干细胞群中let-7的低表达，以维持其多能性和增殖能力。在正常生理条件下，LIN28B 在胚胎和胎儿组织中表达最高，包括胎盘、胎肝和发育中的肠道。在这些组织中，LIN28B 对 let-7 的抑制作用促进细胞生长、代谢活动和分化延迟，从而建立起一条 LIN28B-let-7 轴，该轴如同一个“发育计时器”，调控细胞从增殖状态向分化状态的转变。在癌症中，LIN28B 在多种实体瘤和血液系统恶性肿瘤中均存在过表达。在小鼠模型中，肠道靶向表达 LIN28B 会导致肠道肥大、隐窝扩张和腺癌形成，而这些过程均依赖于 let-7 的抑制。这表明，LIN28B 在成人组织中的持续活性会将其发育生长程序转化为致癌驱动因子，其机制是通过长期解除 let-7 介导的细胞周期和存活信号通路的抑制。 LIN28B 还具有不依赖于 let-7 的作用：它能结合参与代谢、细胞周期调控和上皮-间质转化的特定 mRNA，增强其翻译或稳定性，并影响癌症干细胞特性、代谢重编程和免疫逃逸。因此，LIN28B 将 miRNA 通路调控与 mRNA 水平的直接调控相结合，从而协调多种癌症特征，包括干性、增殖、迁移和治疗耐药性。LIN28B 的表达受转录因子（例如 MYC）的调控，MYC 可诱导 LIN28B 表达，从而增强 let-7 的抑制作用并放大 MYC 驱动的转录程序；此外，LIN28B 的 3′ UTR 结合的非编码 RNA 也对其表达进行调控，形成反馈回路。在这些回路中，LIN28B、let-7、MYC 和其他 miRNA 相互影响彼此的水平和活性，从而根据具体情况稳定干细胞样致癌状态或更分化的状态。总的来说，这些研究结果表明 LIN28B 是一种冷休克和锌指 RNA 结合蛋白，它能识别 pri- 和 pre-miRNA 中的 GGAG 基序，阻断其加工并促进尿苷酸化介导的衰变，抑制 let-7 肿瘤抑制网络，并在发育和肿瘤发生过程中协调更广泛的 miRNA 和 mRNA 靶标调控程序，从而决定细胞特性、生长和转移潜能。这使得 LIN28B 成为一种机制丰富的靶点，可用于旨在恢复 let-7 功能或破坏 Lin28 驱动的癌症干性的干预措施。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, FCM 稀释比例
WB IP IF FCM
1:2000 1:50 1:100-1:1000 1:150
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 27 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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