Loricrin C-terminal Antibody [D17A11]

目录号：F3698

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生物描述

特异性 Loricrin C-terminal Antibody [D17A11] 可检测总 Loricrin 蛋白 C 端区域的内源性水平。
背景 角蛋白 C 端结构域构成了这种主要的角质包膜 (CE) 蛋白（占表皮质量的 70% 以上）富含谷氨酰胺和赖氨酸的锚定区，其特征是具有多个 Q/K 对的甘氨酸-丝氨酸环，例如 Gln451/Lys454 簇，这些 Q/K 对作为 ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸异肽键形成的主要转谷氨酰胺酶 1/3 (TGM1/3) 底物，并通过半胱氨酸二硫键进一步增强，从而赋予其不溶性。在角质形成细胞终末分化过程中，Ca²⁺激活的TGM1介导细胞内和细胞外的连续交联，其中C端谷氨酰胺残基脱酰胺生成谷氨酸，使赖氨酸ε-氨基易于进行亲核攻击，从而将角蛋白牢固地锚定在L颗粒中的包膜蛋白/富含脯氨酸的小蛋白（SPR）支架上，并随后锚定在质膜上，最终形成厚度为10-20 nm、机械强度高且不透水和病原体的外壳，其中柔性甘氨酸环可吸收拉伸应力（模量约为100 MPa）。这种通过TGM催化的晶格聚合实现的翻译后不溶化作用，在机制上建立了表皮屏障功能，其转录驱动力来自NFAT、AP1和NRF2介导的LOR上调。显性移码突变截断 C 端，产生富含精氨酸的核定位信号 (NLS) 肽，这些肽错误定位到细胞核并损害交联，显性地破坏终末分化，导致角蛋白角化过度症（LK/Vohwinkel 综合征），其特征是掌跖角化过度、鱼鳞病和由于角质化包膜功能不全而导致的屏障脆弱性。

使用信息

抗体应用 IHC, IF 稀释比例
IHC IF
1:250 1:250
反应性 Rat, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

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