Macrophages/Monocytes Antibody [K8D24]

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生物描述

特异性 Macrophages/Monocytes Antibody [K8D24] 可检测巨噬细胞和单核细胞中表达的内源性蛋白质。
背景 单核细胞和巨噬细胞构成单核吞噬细胞系统，它们起源于骨髓造血干细胞，最初以循环单核细胞的形式存在，约占白细胞总数的2%至8%。这些细胞具有肾形细胞核，寿命较短，仅为1至3天。进入组织后，单核细胞分化为寿命较长的组织驻留巨噬细胞，后者呈变形虫样形态，胞质内含有丰富的空泡。它们共同构成了一个多样化的网络，对先天免疫和维持组织稳态至关重要。单核细胞和巨噬细胞缺乏颗粒，但其动态表面标志物可区分出不同的亚群：经典单核细胞，具有高度炎症性和吞噬性（CD14高表达，CD16阴性）；中间单核细胞，能够产生细胞因子（CD14高表达，CD16阳性）；以及非经典单核细胞，它们巡逻于血管内（CD14阴性，CD16高表达）。所有亚群都拥有强大的吞噬机制，包括用于脂多糖检测的模式识别受体（如TLR4），并表现出高内吞能力。它们的主要功能包括吞噬病原体和死亡细胞，通过MHC II类分子加工抗原并将其呈递给T细胞，以及分泌细胞因子。M1型巨噬细胞释放促炎介质，如白细胞介素-12、白细胞介素-23和活性氧，从而引发炎症；而M2型巨噬细胞则产生抗炎因子，如白细胞介素-10和TGF-β，从而促进炎症消退、组织重塑、胚胎发育（如血管和神经模式形成）以及免疫耐受。单核细胞和巨噬细胞通过巡视组织、募集免疫效应细胞、调节适应性免疫以及融合形成多核巨细胞（例如破骨细胞和朗格汉斯细胞）来维持体内平衡，这些细胞可执行诸如骨吸收等特殊任务。它们的存活依赖于细胞凋亡的平衡，例如Hsp27等蛋白通过抑制caspase-3来延长细胞寿命。吞噬功能障碍与自身免疫性疾病相关，而M2样肿瘤相关巨噬细胞则通过促进Th2免疫反应和血管生成来支持癌症进展。单核细胞功能失调会导致动脉粥样硬化、类风湿性关节炎和神经退行性疾病中的慢性炎症。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, FCM 稀释比例
IHC FCM
1:50-1:300 1:100 - 1:200
反应性 Rat
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 90-100 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

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