Mer Antibody (Rabbit mAb) [C10E14]

目录号：F1198

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生物描述

特异性 Mer Antibody (Rabbit mAb) [C10E14] 可检测内源性 Mer 总蛋白水平。
背景 Mer (MERTK) 是一种跨膜受体酪氨酸激酶，与 AXL 和 TYRO3 同属 TAM 家族，作为表面受体，在视网膜和单核吞噬细胞等系统中调控凋亡细胞的清除、免疫稳态和组织完整性。该受体包含一个胞外区，该胞外区具有串联的免疫球蛋白样结构域和纤连蛋白 III 型结构域，可结合维生素 K 依赖性配体；一个跨膜区段；以及一个胞内酪氨酸激酶结构域，该结构域含有多个调节性酪氨酸残基，在配体结合后发生自磷酸化。Gas6 和蛋白 S 是生理性配体，它们通过层粘连蛋白 G 样结构域与 Mer 结合，而它们的 N 端 Gla 区则与凋亡细胞膜上的磷脂酰丝氨酸接触；这种构象将凋亡靶点呈递给表达 Mer 的吞噬细胞，并使激酶结构域处于激活状态。配体依赖性的Mer激活诱导细胞内酪氨酸的自身磷酸化，并为含SH2结构域的衔接蛋白（如GRB2、GAB1和PI3K调节亚基）创建对接位点。这些衔接蛋白将Mer连接到RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路模块，从而促进细胞骨架重塑、吞噬杯形成以及吞噬细胞在胞葬过程中的存活。Mer信号通路还能上调细胞因子信号抑制蛋白和其他先天免疫负调控因子，从而限制凋亡细胞清除过程中促炎细胞因子的产生，并在视网膜色素上皮等进行大量胞葬的组织中维持非免疫原性环境。视网膜色素上皮细胞表达Mer蛋白，并进行昼夜节律性吞噬脱落的光感受器外节。Gas6和蛋白S协同调控Mer蛋白的节律性激活，它们与Mer蛋白Ig样结构域中不同残基的差异性结合以及配体可用性的时间依赖性变化，共同促成了光感受器外节摄取的每日高峰，这对于长期视觉功能至关重要。巨噬细胞和树突状细胞表达Mer蛋白以及AXL和TYRO3蛋白。Mer依赖性凋亡细胞的吞噬作用（暴露于磷脂酰丝氨酸）有助于凋亡消退期的程序化和巨噬细胞极化的调节，其中TAM信号通路与抗炎和组织修复表型具有特征性关联。在多种上皮和血液恶性肿瘤中，MERTK 上调或异位表达，其中 Gas6、Protein S 或其他配体（如 Tubby、Tulp1 和 Galectin-3）激活 Mer 可诱导受体自身磷酸化，并刺激下游 PI3K/Akt、MAPK 和 STAT 信号通路，从而支持肿瘤细胞的存活、增殖、化疗耐药性和运动性，并且肿瘤或基质细胞的 Mer 驱动的胞吞作用与 PD-L1 诱导和免疫逃逸相关。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC 稀释比例
WB IP IHC
1:2000 1:20 1:1000-1:2000
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 110 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:2000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: 293T