Met Antibody [K15N1] Datasheet

生物描述

特异性	Met Antibody [K15N1] 可检测内源性 Met 总蛋白水平。
背景	MET（也称为c-MET或肝细胞生长因子受体）是一种受体酪氨酸激酶（RTK），以二硫键连接的异二聚体形式发挥作用，由胞外α链和跨膜β链组成。它对胚胎发育、伤口愈合和组织再生至关重要，这主要通过其与肝细胞生长因子（HGF，也称为散布因子）的高亲和力结合来实现。MET具有一个胞外Sema结构域，该结构域是一个负责与HGF结合的七叶β螺旋桨结构，其后是PSI结构域和四个IPT结构域，这些结构域赋予其配体特异性和稳定性。该受体通过单次螺旋穿过细胞膜，包含一个胞内近膜区段、一个含有关键激活环酪氨酸残基（Tyr1234 和 Tyr1235）的酪氨酸激酶结构域，以及一个含有重要对接位点（如 Tyr1349，对 Gab1 等衔接蛋白的募集至关重要）和 Tyr1003（c-Cbl 介导的泛素化位点）的 C 端尾部。HGF 结合后，MET 发生二聚化并进行顺序性自磷酸化：首先在 Tyr1234/1235 位点磷酸化以激活激酶，随后其他位点（例如 Tyr1349）磷酸化，这些位点作为募集 Gab1/2、Grb2、PI3K、PLCγ 和 STAT3 等信号衔接蛋白的平台。这些相互作用激活多个下游通路，包括PI3K/AKT（细胞存活和迁移）、RAS-MAPK（增殖）、FAK/Src/整合素（运动和侵袭）以及STAT（分化）。Tyr1003位点的磷酸化可促进c-Cbl介导的泛素化，进而导致受体内吞和溶酶体降解，从而减弱信号。MET对于器官发生过程至关重要，例如肝脏发生、肌细胞发生、肾脏发生，以及维持成人组织稳态，尤其是在形态发生和组织修复过程中驱动上皮-间质转化（EMT）。基因扩增、激活突变（尤其是在激酶结构域热点区域）、HGF过表达或自分泌/旁分泌环路导致的MET异常激活，会促进多种癌症（例如非小细胞肺癌、胃癌、肾癌、肝细胞癌）的发生。这会导致持续增殖、侵袭、转移、血管生成（部分通过 VEGF），以及对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂等疗法的耐药性。

特异性

Met Antibody [K15N1] 可检测内源性 Met 总蛋白水平。

背景

MET（也称为c-MET或肝细胞生长因子受体）是一种受体酪氨酸激酶（RTK），以二硫键连接的异二聚体形式发挥作用，由胞外α链和跨膜β链组成。它对胚胎发育、伤口愈合和组织再生至关重要，这主要通过其与肝细胞生长因子（HGF，也称为散布因子）的高亲和力结合来实现。MET具有一个胞外Sema结构域，该结构域是一个负责与HGF结合的七叶β螺旋桨结构，其后是PSI结构域和四个IPT结构域，这些结构域赋予其配体特异性和稳定性。该受体通过单次螺旋穿过细胞膜，包含一个胞内近膜区段、一个含有关键激活环酪氨酸残基（Tyr1234 和 Tyr1235）的酪氨酸激酶结构域，以及一个含有重要对接位点（如 Tyr1349，对 Gab1 等衔接蛋白的募集至关重要）和 Tyr1003（c-Cbl 介导的泛素化位点）的 C 端尾部。HGF 结合后，MET 发生二聚化并进行顺序性自磷酸化：首先在 Tyr1234/1235 位点磷酸化以激活激酶，随后其他位点（例如 Tyr1349）磷酸化，这些位点作为募集 Gab1/2、Grb2、PI3K、PLCγ 和 STAT3 等信号衔接蛋白的平台。这些相互作用激活多个下游通路，包括PI3K/AKT（细胞存活和迁移）、RAS-MAPK（增殖）、FAK/Src/整合素（运动和侵袭）以及STAT（分化）。Tyr1003位点的磷酸化可促进c-Cbl介导的泛素化，进而导致受体内吞和溶酶体降解，从而减弱信号。MET对于器官发生过程至关重要，例如肝脏发生、肌细胞发生、肾脏发生，以及维持成人组织稳态，尤其是在形态发生和组织修复过程中驱动上皮-间质转化（EMT）。基因扩增、激活突变（尤其是在激酶结构域热点区域）、HGF过表达或自分泌/旁分泌环路导致的MET异常激活，会促进多种癌症（例如非小细胞肺癌、胃癌、肾癌、肝细胞癌）的发生。这会导致持续增殖、侵袭、转移、血管生成（部分通过 VEGF），以及对 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂等疗法的耐药性。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Mouse Monoclonal Antibody

MW

145, 170 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

Met Antibody [K15N1]

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