MIRAB13 Antibody (Mouse mAb) [F12J3]

目录号：F4314

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生物描述

特异性 MIRAB13 Antibody (Mouse mAb) [F12J3] 可检测内源性 MIRAB13 总蛋白水平。
背景 MICALL1，也称为MIRAB13或与Rab13相互作用的分子，是一种胞质MICAL家族效应蛋白，主要定位于循环内体和晚期内体膜的胞质侧，并在脂质依赖性调控内吞循环、货物运输和膜管化过程中发挥作用。该蛋白包含一个N端钙调蛋白同源结构域、一个LIM锌结合区、一个富含脯氨酸的中央卷曲螺旋区段和一个C端Rab结合区，并具有磷脂酸结合活性（有利于循环内体脂质）以及对Rab蛋白的小GTP酶结合活性。MICALL1直接与GTP结合的Rab13相互作用，并与MICAL蛋白具有相似的结构域组成。钙调蛋白同源区和Rab13结合区形成对Rab13敏感的分子内接触，GTP-Rab13破坏该接触会导致构象变化，从而暴露效应蛋白界面并将MICALL1定位于晚期内体膜上。在内体膜上，MICALL1作为Rab35、Rab13及相关小GTP酶的下游效应蛋白发挥作用，并结合富含磷脂酸的结构域，在那里与EHD1和其他胞质伴侣蛋白组装成多蛋白复合物，以支持膜管形成、内体载体形成和货物分选。 MICALL1参与受体介导的内吞作用的后期步骤，并调控表皮生长因子受体（EGFR）的转运。MICALL1在晚期内体上的富集与EGFR在该区室的积累相关，而MICALL1的缺失则与分散的内吞EGFR和增强的受体降解相关，这表明MICALL1在晚期内吞转运和分选决策中发挥着明确的作用。MICALL1还参与内吞蛋白的慢速内吞循环，使其返回质膜，并将货物递送至细胞表面。这些功能使MICALL1蛋白处于循环内体通路中，该通路控制着受体和黏附分子的稳态表达，从而影响细胞极性和信号传导反应。MICALL1将EHD1募集到初级纤毛，并与中心粒上的微管蛋白结合，协调纤毛发生，并作为纤毛转运模块的一部分发挥作用，该模块连接内体循环与初级纤毛的形成和维持。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, ELISA 稀释比例
WB IP IF
1:100-1:1000 1:200-1:400 1:50-1:500
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 93 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IF

Validated by Selleck

  • Immunofluorescent analysis of Hela cells using F4314 (green, 1:50), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Hela, Lane 2: MCF7