MMP-3 Antibody [K11K15] Datasheet

生物描述

特异性	MMP-3 Antibody [K11K15] 可检测内源性 MMP-3 总蛋白水平。
背景	基质金属蛋白酶-3 (MMP-3)，又称基质溶解素-1，是MMP家族中的一种锌依赖性内肽酶，能够降解细胞外基质成分，在胚胎发育、伤口愈合以及癌症侵袭和关节炎等病理过程中对组织重塑至关重要。MMP-3具有模块化结构，包括：N端前结构域（约80个氨基酸），通过半胱氨酸开关与催化锌离子结合来维持其潜伏状态；中央催化结构域，其中包含保守的HExGHxxGxxH基序，三个组氨酸残基与Zn²⁺配位进行蛋白水解；铰链区；以及C端血红素结合蛋白样结构域，该结构域有助于底物特异性。 MMP-3 的血红素结合样结构域能够通过 Cat-Hpx 的协同作用识别三螺旋胶原蛋白中 Gly-X-Phe 基序的 Phe 残基，从而实现高效的胶原蛋白水解，并具有广泛的底物谱，包括聚集蛋白聚糖、纤连蛋白和层粘连蛋白。MMP-3 通过蛋白水解去除其前结构域而被激活，这种蛋白水解通常由弗林蛋白酶或其他 MMP 完成。激活后的 MMP-3 可参与多种生物学过程，例如炎症（通过加工 IL-1β、趋化因子和生长因子等细胞因子）、肿瘤进展（通过切割 E-钙黏蛋白促进上皮-间质转化和转移）以及心血管疾病（通过动脉粥样硬化斑块不稳定）。MMP-3 的失调与关节炎中的关节破坏和癌症进展相关，其机制是通过上调 AP-1/NF-κB 位点的转录。

特异性

MMP-3 Antibody [K11K15] 可检测内源性 MMP-3 总蛋白水平。

背景

基质金属蛋白酶-3 (MMP-3)，又称基质溶解素-1，是MMP家族中的一种锌依赖性内肽酶，能够降解细胞外基质成分，在胚胎发育、伤口愈合以及癌症侵袭和关节炎等病理过程中对组织重塑至关重要。MMP-3具有模块化结构，包括：N端前结构域（约80个氨基酸），通过半胱氨酸开关与催化锌离子结合来维持其潜伏状态；中央催化结构域，其中包含保守的HExGHxxGxxH基序，三个组氨酸残基与Zn²⁺配位进行蛋白水解；铰链区；以及C端血红素结合蛋白样结构域，该结构域有助于底物特异性。 MMP-3 的血红素结合样结构域能够通过 Cat-Hpx 的协同作用识别三螺旋胶原蛋白中 Gly-X-Phe 基序的 Phe 残基，从而实现高效的胶原蛋白水解，并具有广泛的底物谱，包括聚集蛋白聚糖、纤连蛋白和层粘连蛋白。MMP-3 通过蛋白水解去除其前结构域而被激活，这种蛋白水解通常由弗林蛋白酶或其他 MMP 完成。激活后的 MMP-3 可参与多种生物学过程，例如炎症（通过加工 IL-1β、趋化因子和生长因子等细胞因子）、肿瘤进展（通过切割 E-钙黏蛋白促进上皮-间质转化和转移）以及心血管疾病（通过动脉粥样硬化斑块不稳定）。MMP-3 的失调与关节炎中的关节破坏和癌症进展相关，其机制是通过上调 AP-1/NF-κB 位点的转录。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

60 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: U-87 MG, Lane 2: U-118 MG, Lane 3: 3T3, Lane 4: PC-12