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产品描述
产品介绍：
小鼠造血祖细胞阴性分选试剂盒可以实现轻松高效地从小鼠骨髓样本中分离高纯度小鼠祖细胞。
应用范围：
在该阴性选择过程中，非造血干细胞和非祖细胞（CD5、CD11b、CD19、CD45R/B220、Ly6G/C(Gr-1)、TER119、7-4）会被抗体复合物与磁珠标记从而靶向去除。通过磁极将被磁珠标记的细胞与未被标记的目的细胞分离，从而实现小鼠造血祖细胞分选的目的。得到的小鼠造血祖细胞可进行流式细胞术、细胞培养或基于细胞的实验等。
产品优势：
操作简单、快捷，且无需分离柱；
纯度高达84%；
分选得到的细胞不带标记。
组分：
小鼠造血祖细胞分离抗体混合液，0.2 mL；
链霉亲和素磁珠，2 x 1 mL。
储存条件：
2 - 8°C储存。
实验步骤
实验前准备
分选 buffer 为含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2mM EDTA 和 0.5% BSA 的 PBS，需预先通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌。
实验步骤
1. 样本准备:
b. 离心完成后，弃上清，加入5 ml ACK 红细胞裂解液，室温裂解 5 min，再加入 20 ml PBS，500 g，离心 5 min。
注意：红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间。少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度。
c. 离心完成后，弃上清，将脾细胞重悬于 PBS，细胞悬液用 70 μm 细胞筛网过滤后，计数。计数完成后，继续以 500 g，离心 5 min。
d. 离心完成后，弃上清，将细胞重悬于分选 buffer 中，调整细胞密度为 1×108 cells/ml。
2. 将 100 μl 细胞悬液（1×107 个细胞）加入无菌流式管底部，再加入2 μl Biotin-Ab Mix，混匀后 4℃ 孵育 10 min。
注意：加入细胞悬液时将细胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根据所使用磁力架特点也可使用离心管进行细胞分选。如果分选更多细胞，则按比例增加 Biotin-Ab Mix 用量。
3. 孵育完成后，在流式管中加入 20 μl 链霉亲和素磁珠（使用前涡旋振荡重悬磁珠），混匀后 4℃ 孵育 10 min。孵育过程中应轻轻敲打管壁 1~2 次，防止细胞和磁珠沉降。
注意：如果分选更多细胞，则按比例增加链霉亲和素磁珠用量。例如分选 5×107 细胞，则应在 500 μl 细胞悬液中加入 10 μl Biotin-Ab Mix 和 100 μl 链霉亲和素磁珠。如果分选少于 1×107 个细胞，则将细胞悬液体积补至 100 μl，使用 2 μl Biotin-Ab Mix 和 20 μl 链霉亲和素磁珠。
4. 孵育完成后，在流式管加入 2.5 ml 分选 buffer，以移液器上下混合吹打 5 次混匀（避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀）。
5. 将含有细胞的分选流式管置于磁力架上（若没有合适的磁力架，可将流式管中液体转移到 15 mL 离心管中再置于磁力架上），静置5 min。
6. 将细胞悬液倒入无菌离心管中（倾倒过程中流式管不要脱离磁力架）或用吸管吸入离心管中（勿将液体吸尽，防止吸到磁珠），500 g，离心5 min。细胞悬液中即包含纯化的小鼠造血祖细胞，离心后弃上清，收集细胞。
7. 根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，即可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。
以小鼠脾脏为例
a. 制备单细胞悬液：在 70 μm 细胞筛网上研磨脾脏，以预冷的 PBS 冲洗细胞筛网，收集细胞悬液于 50 ml 离心管中，500 g，离心 5 min。b. 离心完成后，弃上清，加入5 ml ACK 红细胞裂解液，室温裂解 5 min，再加入 20 ml PBS，500 g，离心 5 min。
注意：红细胞裂解步骤可根据所用裂解液不同调整用量及时间。少量红细胞残留不会影响后续分选及细胞纯度。
c. 离心完成后，弃上清，将脾细胞重悬于 PBS，细胞悬液用 70 μm 细胞筛网过滤后，计数。计数完成后，继续以 500 g，离心 5 min。
d. 离心完成后，弃上清，将细胞重悬于分选 buffer 中，调整细胞密度为 1×108 cells/ml。
2. 将 100 μl 细胞悬液（1×107 个细胞）加入无菌流式管底部，再加入2 μl Biotin-Ab Mix，混匀后 4℃ 孵育 10 min。
注意：加入细胞悬液时将细胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根据所使用磁力架特点也可使用离心管进行细胞分选。如果分选更多细胞，则按比例增加 Biotin-Ab Mix 用量。
3. 孵育完成后，在流式管中加入 20 μl 链霉亲和素磁珠（使用前涡旋振荡重悬磁珠），混匀后 4℃ 孵育 10 min。孵育过程中应轻轻敲打管壁 1~2 次，防止细胞和磁珠沉降。
注意：如果分选更多细胞，则按比例增加链霉亲和素磁珠用量。例如分选 5×107 细胞，则应在 500 μl 细胞悬液中加入 10 μl Biotin-Ab Mix 和 100 μl 链霉亲和素磁珠。如果分选少于 1×107 个细胞，则将细胞悬液体积补至 100 μl，使用 2 μl Biotin-Ab Mix 和 20 μl 链霉亲和素磁珠。
4. 孵育完成后，在流式管加入 2.5 ml 分选 buffer，以移液器上下混合吹打 5 次混匀（避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀）。
5. 将含有细胞的分选流式管置于磁力架上（若没有合适的磁力架，可将流式管中液体转移到 15 mL 离心管中再置于磁力架上），静置5 min。
6. 将细胞悬液倒入无菌离心管中（倾倒过程中流式管不要脱离磁力架）或用吸管吸入离心管中（勿将液体吸尽，防止吸到磁珠），500 g，离心5 min。细胞悬液中即包含纯化的小鼠造血祖细胞，离心后弃上清，收集细胞。
7. 根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，即可用于后续分子生物学或细胞生物学实验。