MRP1/ABCC1 Antibody (Rabbit mAb) [M22C19]

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生物描述

特异性 MRP1/ABCC1 Antibody (Rabbit mAb) [M22C19] 可检测内源性 MRP1/ABCC1 总蛋白水平。
背景 MRP1，又称ABCC1，是ATP结合盒C亚家族的全转运蛋白，主要定位于质膜，作为一种多特异性有机阴离子外排泵，可转运内源性代谢物、结合脂质以及包括多种抗癌药物在内的多种外源性物质。该蛋白包含三个跨膜结构域（共17个跨膜螺旋）和两个胞质核苷酸结合结构域；额外的N端跨膜束有助于其靶向定位和维持表面稳定性，而典型的核心跨膜结构域则形成一个双腔底物结合腔，该腔将ATP的结合和水解与较大的构象变化偶联，从而使底物在胞质侧和胞外侧之间交替进入。 MRP1 能够识别并转运亲脂性阴离子底物，尤其偏好谷胱甘肽 (GSH) 结合物和 GSH 依赖性复合物，包括白三烯 C4、氧化型谷胱甘肽、雌二醇-17β-葡糖醛酸苷、胆红素、硫酸胆汁酸以及多种药物-GSH 对。此外，它还能转运 GSH 非依赖性底物，例如甲氨蝶呤和某些环状二核苷酸。冷冻电镜分析表明，ABCC1 利用一个可塑性结合口袋，该口袋能够容纳 GSH 结合物、双分子 GSH-底物对以及非 GSH 配体。ATP 的结合和水解驱动底物结合状态、释放前状态和释放后状态的转变，并伴随核苷酸从两个核苷酸结合位点的顺序释放，从而使转运蛋白重置以进行后续循环。 MRP1广泛表达于多种屏障和解毒组织，包括肺、肠、肝、睾丸、胎盘、血脑屏障和造血细胞。在极化上皮细胞中，MRP1定位于基底外侧，并在血脑屏障和血胎界面高表达，从而促进有机阴离子和外源性物质向血液或母体循环的输出，并有助于保护组织免受毒性化合物和脂质过氧化产物的侵害。该转运蛋白通过输出谷胱甘肽结合物和半胱氨酰白三烯参与谷胱甘肽和类花生酸代谢途径；通过控制氧化型谷胱甘肽和4-羟基壬烯醛加合物的水平来影响细胞氧化还原稳态；此外，它还输出免疫刺激性的环磷酸鸟苷-AMP，以在细胞间传递cGAS-STING依赖的固有免疫信号。在肿瘤学中，MRP1 通过减少蒽环类药物、长春花生物碱、鬼臼毒素、喜树碱衍生物和几种靶向药物的细胞内积累来赋予多药耐药性，而高 ABCC1 表达与肺癌、乳腺癌、前列腺肿瘤和神经母细胞瘤等癌症的不良反应和预后相关，在这些癌症中，它通常与其他转运蛋白（包括 P-gp）同时出现。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, FCM 稀释比例
WB IP IHC FCM
1:1000 1:30 1:1000 1:600
反应性 Mouse, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 172 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: A549, Lane 2: HepG2, Lane 3: K562, Lane 4: NIH/3T3