MTHFR Antibody (Rabbit mAb) [N5P2]

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生物描述

特异性 MTHFR Antibody (Rabbit mAb) [N5P2] 可检测内源性 MTHFR 总蛋白水平。
背景 亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是一种黄素蛋白，它通过催化5,10-亚甲基四氢叶酸不可逆地还原为5-甲基四氢叶酸，将叶酸衍生的单碳单元输送到蛋氨酸循环。MTHFR以非共价键结合FAD作为必需的辅因子，并通过乒乓双底物催化机制从NADPH传递电子。真核生物的MTHFR酶是同源二聚体，每个单体由一个N端催化结构域构成，该结构域具有保守的TIM桶状折叠，容纳FAD辅因子；并通过一个延伸的结构域间连接区与一个结构独特的C端调节结构域相连，该调节结构域介导二聚化并赋予变构反馈抑制作用，而细菌MTHFR同源物中则不存在该调节结构域。全长人类酶的冷冻电镜结构显示，MTHFR 会根据其调节域中甲基循环代谢物的种类在两种构象状态之间转换：在活性状态下，单个 S-腺苷高半胱氨酸分子与调节域结合，使催化域保持柔性，活性位点暴露；而在抑制状态下，调节口袋被重塑，暴露出第二个先前被封闭的结合位点，该位点可容纳两个 S-腺苷甲硫氨酸分子，这种双 SAM 结合构象会重排域间连接区，使特定的酪氨酸残基插入活性位点并直接位于 FAD 辅因子上方，从而物理性地阻止底物接近。这种 SAM 依赖性变构抑制可通过磷酸化进行调节：MTHFR N 端区域的多个丝氨酸/苏氨酸残基被激酶 DYRK1A/2 和 GSK3A/B 磷酸化，磷酸化的 MTHFR 对 SAM 的抑制常数较低，使得磷酸化的酶在给定的 SAM 浓度下对变构关闭更敏感，而 MTHFR 的磷酸化本身由通过同一 C 端调节域感知的足够的细胞 SAM 水平来维持，从而形成一个将一碳代谢状态与酶磷酸化状态联系起来的反馈回路。利用CRISPR基因敲入技术消除MTHFR磷酸化的细胞系，其5-甲基四氢叶酸（5-甲基四氢叶酸）的基础产量显著升高，且与亲代细胞不同，在同型半胱氨酸处理后，5-甲基四氢叶酸的产量并未进一步增加。这直接表明，MTHFR需要依赖于磷酸化的SAM敏感性才能根据细胞内同型半胱氨酸和蛋氨酸的需求动态调节其产量，而非以固定的催化速率运行。由于SAM既是MTHFR的变构抑制剂，又是胱硫醚β-合成酶的变构激活剂，因此这种小分子能够相互调控同型半胱氨酸代谢中甲基化和转硫途径之间的代谢通量。常见的C677T多态性会降低酶的稳定性和活性，这种功能降低的变异体与同型半胱氨酸水平升高以及心血管和神经系统疾病风险增加相关。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF 稀释比例
WB IP IF
1:1000 1:30 1:100
反应性 Mouse, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 75 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: Jurkat, Lane 2: HT29, Lane 3: RAW264.7, Lane 4: NIH/3T3