Musashi 1 / Msi1 Antibody (Rabbit mAb) [J9N24]

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生物描述

特异性 Musashi 1 / Msi1 Antibody (Rabbit mAb) [J9N24] 可检测内源性 Musashi 1 / Msi1 总蛋白水平。
背景 Musashi-1（也称MSI1）是一种RNA结合蛋白，在神经祖细胞和神经干细胞中高表达。它通过特定的共有序列识别靶mRNA，该共有序列为体外筛选鉴定的(G/A)U(n)AGU基序重复序列，Musashi-1通过串联RNA识别基序与该序列结合。一个已验证的生理靶点是哺乳动物numb mRNA，该mRNA编码Notch信号通路的膜相关拮抗剂。Musashi-1特异性地结合该转录本的3'非翻译区，无论是在重组结合实验还是在细胞中均观察到此现象。在细胞中，亲和沉淀实验证实了Musashi-1与内源性m-numb mRNA的相互作用。 Musashi-1 的表达驱动内源性 Numb 蛋白的下调，而不改变 Numb mRNA 的水平，这表明 Musashi-1 的作用是翻译水平而不是转录稳定性水平。由于 Numb 蛋白通常与 RBP-Jkappa 一起阻止 Notch 受体的切割和 Notch 胞内结构域的核转位，Musashi-1 对 Numb 的翻译抑制解除了这种抑制，并通过 Notch1-RBP-Jkappa-HES1 轴增强了 Notch 信号传导，从而在单个 RNA 结合事件和主要干细胞维持信号通路的激活之间提供了直接的分子联系。这种翻译抑制机制涉及对共同结合伴侣的直接竞争：Musashi-1 通过其 C 端区域与 poly(A) 结合蛋白 (PABP) 结合，这种结合与翻译起始因子 eIF4G 直接竞争相同的 PABP 相互作用表面。由于 eIF4G-PABP 相互作用是 mRNA 环化和募集小核糖体亚基所必需的，Musashi-1 对 eIF4G 的竞争性置换特异性地阻断了 80S 核糖体复合物的组装，而 48S 前起始复合物的组装不受影响，这表明 Musashi-1 的抑制作用定位于翻译起始的后期特定步骤。从 Musashi-1 中删除 PABP 相互作用域会消除其抑制报告 mRNA 翻译的能力，这证实了 PABP 的结合，而不仅仅是 RNA 结合活性，是 Musashi-1 发挥抑制功能的机制性必要条件。除了 Numb 之外，Musashi-1 及其旁系同源物 Musashi-2 还调节多个致癌通路（包括 PTEN/mTOR、TGF-beta/SMAD3、MYC 和 cMET）内转录本的稳定性和翻译，而 Musashi-1 表达升高预示着结直肠癌、胶质母细胞瘤、肺癌、胰腺癌和几种白血病的不良预后。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, FCM 稀释比例
WB IP IHC FCM
1:1000 1:1000 1:500 1:50
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 39 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: SH-SY5Y, Lane 2: PC12, Lane 3: Neuro-2a