NEDD4-L Antibody (Mouse mAb) [P22P8]

目录号：F4261

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生物描述

特异性 NEDD4-L Antibody (Mouse mAb) [P22P8] 可检测内源性 NEDD4-L 总蛋白水平。
背景 NEDD4-L（也称为NEDD4-2）是NEDD4家族中的一种HECT型E3泛素连接酶，它利用C2-WW-HECT结构域识别并泛素化多种膜蛋白和信号蛋白，从而将表面受体和通道的更新与离子稳态、生长因子信号传导和应激反应相偶联。NEDD4-L的N端C2结构域以钙和磷脂依赖的方式靶向膜；中央WW结构域结合底物或衔接蛋白中的PY基序和相关降解子；C端HECT结构域从E2酶接受泛素，形成瞬态硫酯中间体，然后将泛素转移到特定底物或相关信号因子上的赖氨酸残基上。通过这种模块化结构，NEDD4-L 调控多种离子通道和转运蛋白，包括上皮钠通道 ENaC、Na⁺-Cl⁻ 共转运蛋白 NCC 以及多种电压门控 Na⁺ 通道。NEDD4-L 通过促进这些蛋白的泛素化、内吞作用以及溶酶体或蛋白酶体降解，限制肾脏和气道上皮细胞顶端对 Na⁺ 的重吸收，从而维持血压和体液平衡。此外，NEDD4-L 还靶向生长和存活信号通路组分；它泛素化活化的受体，例如 NTRK1 以及 TGF-β 和 Wnt 通路的组成部分；并且与密切相关的 NEDD4 共同泛素化肠隐窝中的 Wnt 共受体 LGR5，从而抑制 Wnt 信号传导，并控制肠道干细胞的启动和肠道稳态。上游调控回路通过磷酸化和衔接蛋白结合来调节NEDD4-L的活性：激酶如SGK1和AKT磷酸化NEDD4-L上的特定位点，形成14-3-3蛋白的对接位点，从而抑制NEDD4-L与ENaC等底物的结合并减少泛素化；同时，NDFIP1/2衔接蛋白将NEDD4-L募集到特定的货物和细胞区室；去泛素化酶如USP2-45通过去除自身泛素链来调节NEDD4-L的稳定性。在癌症生物学中，NEDD4-L控制着参与自噬、生长因子信号传导和上皮-间质转化的底物，包括ULK1、Notch、EGFR和Wnt级联的组成部分以及各种转运蛋白； NEDD4-L表达或功能的改变与肿瘤抑制或促肿瘤作用相关，这取决于其在特定情况下主要底物是致癌驱动因子还是增殖和存活的负调控因子。遗传学和关联研究数据表明，NEDD4L变异与人类高血压和肾脏盐代谢异常有关。小鼠模型显示，NEDD4-L缺失或功能降低会增加质膜上ENaC和NCC的丰度，从而增加Na⁺摄取并导致盐敏感性高血压。目前，选择性调节上皮细胞和肿瘤细胞中的NEDD4-L活性正被研究作为一种策略，用于调节离子转运、抑制异常的Wnt或TGF-β信号通路或影响gasdermin依赖性细胞死亡通路。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IF, ELISA 稀释比例
WB IP IF
1:100-1:1000 1:200-1:400 1:50-1:500
反应性 Human, Mouse, Rat
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 112 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: RAW 264.7, Lane 2: NIH/3T3