Neuropilin-1 Antibody [C24N3] Datasheet

生物描述

特异性	Neuropilin-1 Antibody [C24N3] 可检测内源性 Neuropilin-1 总蛋白水平。
背景	神经纤毛蛋白-1 (NRP1) 是一种由923个氨基酸组成的单次跨膜糖蛋白，是神经纤毛蛋白家族中的一种共受体，该家族还包括NRP1和NRP2。NRP1本身缺乏酶活性，但可通过分别与Plexin-A和VEGFR2形成全受体复合物，增强轴突导向中信号素-3A和血管生成中VEGF-A165的信号传导特异性。NRP1的胞外区包含两个CUB结构域a1和a2，用于结合Sema3A；两个凝血因子VIII同源结构域b1和b2，它们通过Arg/Arg/Lys三联体作为VEGF-A165在7-8外显子区域的主要对接位点；以及一个MAM球状结构域c，用于Plexin和VEGFR的二聚化。随后是一个跨膜螺旋d，以及一个由44个氨基酸组成的短胞质尾，该胞质尾具有SEA或PDS基序，可与GIPC1和Syndecan结合，进行PDZ介导的运输。二聚体b1b1平台选择性地容纳VEGF-A165的C端螺旋，并排除PlGF和TGFβ。NRP1发挥轴突排斥作用，其中Sema3A-NRP1-PlexinA1四聚体募集R-Ras GAP1和collapsin反应介质蛋白，导致F-肌动蛋白解聚和整合素内化，从而使生长锥塌陷，排斥约90%的交感神经轴突； NRP1定位于丝状伪足，通过PI3K、Akt和FAK增强VEGF-A165-VEGFR2信号通路，促进血管生成顶端细胞的定向迁移和出芽。NRP1敲除胚胎表现出与VEGF单倍体不足类似的血管分支缺陷；此外，NRP1还通过GIPC1内体循环整合素α5β1，从而促进纤连蛋白介导的细胞黏附和侵袭。NRP1对心血管和神经元发育至关重要，包括视交叉交叉和淋巴管瓣膜形成；通过Sema3A调节树突棘密度，从而影响突触可塑性；以及通过支持调节性T细胞迁移来维持免疫耐受。NRP1在胶质瘤和乳腺癌中过表达，并通过不依赖于VEGFR的Rac1激活和神经周围侵袭驱动肿瘤转移。

特异性

Neuropilin-1 Antibody [C24N3] 可检测内源性 Neuropilin-1 总蛋白水平。

背景

神经纤毛蛋白-1 (NRP1) 是一种由923个氨基酸组成的单次跨膜糖蛋白，是神经纤毛蛋白家族中的一种共受体，该家族还包括NRP1和NRP2。NRP1本身缺乏酶活性，但可通过分别与Plexin-A和VEGFR2形成全受体复合物，增强轴突导向中信号素-3A和血管生成中VEGF-A165的信号传导特异性。NRP1的胞外区包含两个CUB结构域a1和a2，用于结合Sema3A；两个凝血因子VIII同源结构域b1和b2，它们通过Arg/Arg/Lys三联体作为VEGF-A165在7-8外显子区域的主要对接位点；以及一个MAM球状结构域c，用于Plexin和VEGFR的二聚化。随后是一个跨膜螺旋d，以及一个由44个氨基酸组成的短胞质尾，该胞质尾具有SEA或PDS基序，可与GIPC1和Syndecan结合，进行PDZ介导的运输。二聚体b1b1平台选择性地容纳VEGF-A165的C端螺旋，并排除PlGF和TGFβ。NRP1发挥轴突排斥作用，其中Sema3A-NRP1-PlexinA1四聚体募集R-Ras GAP1和collapsin反应介质蛋白，导致F-肌动蛋白解聚和整合素内化，从而使生长锥塌陷，排斥约90%的交感神经轴突； NRP1定位于丝状伪足，通过PI3K、Akt和FAK增强VEGF-A165-VEGFR2信号通路，促进血管生成顶端细胞的定向迁移和出芽。NRP1敲除胚胎表现出与VEGF单倍体不足类似的血管分支缺陷；此外，NRP1还通过GIPC1内体循环整合素α5β1，从而促进纤连蛋白介导的细胞黏附和侵袭。NRP1对心血管和神经元发育至关重要，包括视交叉交叉和淋巴管瓣膜形成；通过Sema3A调节树突棘密度，从而影响突触可塑性；以及通过支持调节性T细胞迁移来维持免疫耐受。NRP1在胶质瘤和乳腺癌中过表达，并通过不依赖于VEGFR的Rac1激活和神经周围侵袭驱动肿瘤转移。

使用信息

抗体应用

WB, IP, FCM

稀释比例

WB	IP	FCM
1:1000	1:100	1:50 - 1:200

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

120-140 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: PC-3, Lane 2: HT1080, Lane 3: MDA-MB-231