NFAT2 Antibody (Mouse mAb) [P20K6]

目录号：F1044

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生物描述

特异性 NFAT2 Antibody (Mouse mAb) [P20K6] 可检测内源性 NFAT2 总蛋白水平。
背景 NFAT2，又称NFATc1，与NFAT1、NFAT3和NFAT4同属活化T细胞钙调核因子家族。NFAT2与这些家族成员共享一个保守的Rel同源DNA结合域，但其独特的N端调控域包含钙调磷酸酶对接基序。在静息状态下，NFAT2位于细胞质中，处于高度磷酸化、转录不活跃的状态，其核定位信号被掩盖。受体结合后，细胞内钙离子浓度持续升高，激活钙调蛋白，进而激活钙/钙调蛋白依赖性磷酸酶钙调磷酸酶。钙调磷酸酶由催化亚基钙调磷酸酶A和钙结合亚基钙调磷酸酶B组成。钙调磷酸酶直接与NFAT2结合，使其调控域内的多个丝氨酸残基去磷酸化，从而暴露核定位信号，驱动NFAT2转位至细胞核。在细胞核内，NFAT2 可独立结合特定的 DNA 基序，但通过与 AP-1（Fos-Jun）蛋白直接结合，在复合调控元件处实现高亲和力协同结合，形成 NFAT-AP-1 复合物。该复合物在抗原受体驱动的淋巴细胞活化过程中，协同激活细胞因子基因转录，包括白细胞介素-2。NFAT2 和 NFAT1 共同作用是 T 细胞和 B 细胞完全活化以及细胞因子产生所必需的，这两个因子的基因缺失会导致该反应的消失。在缺乏 AP-1 蛋白结合的情况下，持续的核内 NFAT 活性会驱动一种与 T 细胞无反应性和功能衰竭相关的替代转录程序，这表明 NFAT2 信号传导的结果取决于辅助因子的可用性，而不仅仅是钙调磷酸酶的活性。此外，NFAT2 还调控破骨细胞分化和心脏肥大生长中的基因表达程序，这反映了该通路在淋巴细胞之外更广泛的组织分布。钙调磷酸酶-NFAT2信号通路是免疫抑制剂环孢素A和FK506的药理学靶点，它们通过阻断钙调磷酸酶活性并阻止NFAT2去磷酸化发挥作用。钙调磷酸酶-NFAT2信号通路失调与自身免疫性疾病的发病机制、病理性心脏重塑以及某些癌症中的肿瘤细胞迁移和侵袭有关。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, FCM 稀释比例
WB IHC FCM
1:1000 1:1000 1:1000
反应性 Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 101 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

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