NFAT3 Antibody [H15F22] Datasheet

生物描述

特异性	NFAT3 Antibody [H15F22] 可检测内源性 NFAT3 总蛋白水平。
背景	NFAT3（NFATc4）是一种活化T细胞核因子（NFAT）家族转录因子，主要在T细胞、B细胞和心肌细胞中表达。其结构包含一个固有无序的N端调控结构域，该结构域富含丝氨酸（SRR）和SP重复序列，可作为钙调磷酸酶的结合位点；一个中央Rel同源区（RHR），该区域具有免疫球蛋白样折叠结构，包含一个DNA结合域，可识别GGAAA共有序列和一个核定位信号（NLS）；以及一个C端转录激活结构域（TAD），该结构域可募集CBP/p300共激活因子。当T细胞受体（TCR）或G蛋白偶联受体（GPCR）受到刺激时，胞质内Ca2+浓度升高会激活与钙调蛋白结合的钙调磷酸酶，后者可使SRR/SP区域中14个保守的丝氨酸残基去磷酸化，从而暴露NLS，并使NFAT3转位至细胞核。在细胞核内，NFAT3 同源二聚化或与 AP-1（c-Fos/c-Jun）、GATA3 或 MEF2 等蛋白协同作用，在 NFAT:AP-1 复合位点激活细胞因子基因（IL-2、IL-4、TNF-α）和 FasL 的表达；而在心肌细胞中，NFAT3 通过诱导 BNP 和 MHCα 基因表达驱动病理性肥大。NFAT3 的核输出和胞质滞留可通过 GSK3β、CK1 或 PKA 介导的再磷酸化而恢复。与 NFAT4 的促凋亡作用相反，NFAT3 独特地通过诱导 Trim17 抑制神经元细胞周期进程并促进细胞凋亡；NFAT3 的缺乏会损害 Th2 细胞分化和 IgE 反应。 NFAT3 核过度激活失调通过组成型 IL-2 信号传导导致类风湿性关节炎滑膜炎症、压力超负荷下的心脏肥大和衰竭以及 B 细胞淋巴瘤。

特异性

NFAT3 Antibody [H15F22] 可检测内源性 NFAT3 总蛋白水平。

背景

NFAT3（NFATc4）是一种活化T细胞核因子（NFAT）家族转录因子，主要在T细胞、B细胞和心肌细胞中表达。其结构包含一个固有无序的N端调控结构域，该结构域富含丝氨酸（SRR）和SP重复序列，可作为钙调磷酸酶的结合位点；一个中央Rel同源区（RHR），该区域具有免疫球蛋白样折叠结构，包含一个DNA结合域，可识别GGAAA共有序列和一个核定位信号（NLS）；以及一个C端转录激活结构域（TAD），该结构域可募集CBP/p300共激活因子。当T细胞受体（TCR）或G蛋白偶联受体（GPCR）受到刺激时，胞质内Ca2+浓度升高会激活与钙调蛋白结合的钙调磷酸酶，后者可使SRR/SP区域中14个保守的丝氨酸残基去磷酸化，从而暴露NLS，并使NFAT3转位至细胞核。在细胞核内，NFAT3 同源二聚化或与 AP-1（c-Fos/c-Jun）、GATA3 或 MEF2 等蛋白协同作用，在 NFAT:AP-1 复合位点激活细胞因子基因（IL-2、IL-4、TNF-α）和 FasL 的表达；而在心肌细胞中，NFAT3 通过诱导 BNP 和 MHCα 基因表达驱动病理性肥大。NFAT3 的核输出和胞质滞留可通过 GSK3β、CK1 或 PKA 介导的再磷酸化而恢复。与 NFAT4 的促凋亡作用相反，NFAT3 独特地通过诱导 Trim17 抑制神经元细胞周期进程并促进细胞凋亡；NFAT3 的缺乏会损害 Th2 细胞分化和 IgE 反应。 NFAT3 核过度激活失调通过组成型 IL-2 信号传导导致类风湿性关节炎滑膜炎症、压力超负荷下的心脏肥大和衰竭以及 B 细胞淋巴瘤。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

120-140 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

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Lane 1: A204, Lane 2: A10, Lane 3: Hela