NGF Antibody (Rabbit mAb) [F20J13] Datasheet

生物描述

特异性	NGF Antibody (Rabbit mAb) [F20J13] 可检测内源性 NGF 总蛋白水平。
背景	NGF 是神经营养因子家族的创始成员和原型成员，与 BDNF、NT-3 和 NT-4/5 一起，它通过两种结构不同的受体系统发出信号：高亲和力受体酪氨酸激酶 TrkA 和低亲和力 p75 神经营养因子受体，后者是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，缺乏内在的催化活性。 NGF 结合驱动 TrkA 二聚化和激酶结构域及近膜区酪氨酸残基的自磷酸化，产生对接位点，募集包括 Shc 和 FRS2 在内的衔接蛋白，这些衔接蛋白引发三个主要的下游级联反应：激活 Ras 和 Ras-MAPK/ERK 通路，支持分化和基因转录；通过 Ras 或支架蛋白 Gab1 激活磷脂酰肌醇 3-激酶，通过下游 Akt 信号促进细胞存活和生长；以及激活 PLC-γ1，产生钙和蛋白激酶 C 调节的信号，支持突触可塑性。 TrkA还通过多种汇聚途径与Rac和Cdc42的激活偶联，包括与TrkA组成性结合的Rac-GEF和交换因子Tiam1。这种小GTP酶信号传导重组F-肌动蛋白细胞骨架，解释了NGF梯度在轴突导向过程中引导生长锥运动的能力。p75受体具有两种不同的功能：作为共受体，通过直接的受体-受体相互作用增强TrkA对NGF的结合亲和力和选择性；以及作为独立的信号受体，能够独立于TrkA激活细胞凋亡通路。这是因为，在正常发育过程中，p75是唯一一种在神经营养因子受体中被NGF激活，从而特异性地诱导TrkA阴性神经元死亡的受体。这种双重特性意味着，NGF暴露的生理结果（存活和分化或程序性细胞死亡）取决于特定细胞内TrkA和p75的相对表达水平和二聚化状态，而不仅仅是NGF浓度。TrkA同源二聚体和TrkA-p75异源复合物有利于细胞存活，而p75同源二聚体则有利于凋亡信号传导。此外，持续的NGF-TrkA信号传导还通过内吞信号内体进行逆行运输，这些内体将激活的受体复合物从轴突末梢运回神经元胞体，从而延长了单个配体结合事件的时间和空间范围。

特异性

NGF Antibody (Rabbit mAb) [F20J13] 可检测内源性 NGF 总蛋白水平。

背景

NGF 是神经营养因子家族的创始成员和原型成员，与 BDNF、NT-3 和 NT-4/5 一起，它通过两种结构不同的受体系统发出信号：高亲和力受体酪氨酸激酶 TrkA 和低亲和力 p75 神经营养因子受体，后者是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，缺乏内在的催化活性。 NGF 结合驱动 TrkA 二聚化和激酶结构域及近膜区酪氨酸残基的自磷酸化，产生对接位点，募集包括 Shc 和 FRS2 在内的衔接蛋白，这些衔接蛋白引发三个主要的下游级联反应：激活 Ras 和 Ras-MAPK/ERK 通路，支持分化和基因转录；通过 Ras 或支架蛋白 Gab1 激活磷脂酰肌醇 3-激酶，通过下游 Akt 信号促进细胞存活和生长；以及激活 PLC-γ1，产生钙和蛋白激酶 C 调节的信号，支持突触可塑性。 TrkA还通过多种汇聚途径与Rac和Cdc42的激活偶联，包括与TrkA组成性结合的Rac-GEF和交换因子Tiam1。这种小GTP酶信号传导重组F-肌动蛋白细胞骨架，解释了NGF梯度在轴突导向过程中引导生长锥运动的能力。p75受体具有两种不同的功能：作为共受体，通过直接的受体-受体相互作用增强TrkA对NGF的结合亲和力和选择性；以及作为独立的信号受体，能够独立于TrkA激活细胞凋亡通路。这是因为，在正常发育过程中，p75是唯一一种在神经营养因子受体中被NGF激活，从而特异性地诱导TrkA阴性神经元死亡的受体。这种双重特性意味着，NGF暴露的生理结果（存活和分化或程序性细胞死亡）取决于特定细胞内TrkA和p75的相对表达水平和二聚化状态，而不仅仅是NGF浓度。TrkA同源二聚体和TrkA-p75异源复合物有利于细胞存活，而p75同源二聚体则有利于凋亡信号传导。此外，持续的NGF-TrkA信号传导还通过内吞信号内体进行逆行运输，这些内体将激活的受体复合物从轴突末梢运回神经元胞体，从而延长了单个配体结合事件的时间和空间范围。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Mouse

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

27 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Recombinant Mouse β-NGF Protein