NKCC1 Antibody (Rabbit mAb) [A2N20] Datasheet

生物描述

特异性	NKCC1 Antibody (Rabbit mAb) [A2N20] 可检测内源性 NKCC1 总蛋白水平。
背景	NKCC1（Na⁺-K⁺-2Cl⁻共转运蛋白1，SLC12A2）是阳离子-氯离子共转运蛋白家族中普遍表达的成员，介导Na⁺、K⁺和Cl⁻跨质膜的电中性共转运，在神经元、上皮细胞和其他哺乳动物细胞中，对细胞内Cl⁻积累、渗透平衡和细胞体积控制起着核心作用。该蛋白作为一种次级主动转运蛋白，利用内向的Na⁺梯度和由Na⁺/K⁺-ATP酶维持的K⁺梯度驱动一个Na⁺、一个K⁺和两个Cl⁻离子的净内流，这种离子移动有助于分泌上皮细胞中的NaCl跨上皮分泌，并导致许多神经元中Cl⁻浓度升高。 NKCC1与NKCC2和NCC同属CCC家族的Na⁺依赖性分支，广泛分布于脑、分泌腺、内耳、血管和其他组织中，参与多种基本生理过程，例如上皮细胞Cl⁻分泌、K⁺和Cl⁻稳态、细胞大小调节以及神经元兴奋性控制。该转运蛋白的特征在于其具有多个跨膜螺旋，这些螺旋构成离子转运核心；此外，其胞质N端和C端结构域较大，包含调控性磷酸化位点、与激酶和磷酸酶相互作用的基序以及膜转运和稳定性的决定因素，这些结构域使得NKCC1受到细胞体积和离子环境的严格调控。NKCC1作为分泌上皮细胞中Na⁺、K⁺和Cl⁻的基底外侧摄取途径；该蛋白支持顶端Cl⁻通过通道排出，并促进气道、肠道和外分泌腺的液体分泌。NKCC1活性是分泌性腹泻和气道高分泌等疾病中上皮分泌速率的关键决定因素。在神经系统中，NKCC1表达于神经元和胶质细胞，参与发育中和部分成熟神经元中Cl⁻的积累。其转运活性决定Cl⁻的平衡电位，从而影响GABA_A受体激活是去极化还是超极化，将NKCC1与抑制性与兴奋性GABA信号的调控以及神经元网络的兴奋性联系起来。 NKCC1也在星形胶质细胞中表达，参与离子组成和细胞体积调节，包括对细胞外K⁺升高和缺血状态的反应。在缺血状态下，NKCC1活性与NaCl内流、水进入和星形胶质细胞肿胀相关，并且该共转运蛋白对袢利尿剂（如布美他尼和呋塞米）具有药理学敏感性。NKCC1表达或调控的改变通过影响血管平滑肌和肾脏的盐处理参与高血压的发生发展，并导致脑缺血和多种神经系统疾病中的水肿和神经元过度兴奋；SLC12A2变异体作为人类疾病病因的基因鉴定证实了NKCC1是一种致病性离子转运蛋白，与神经发育、听觉和多系统表型相关。

特异性

NKCC1 Antibody (Rabbit mAb) [A2N20] 可检测内源性 NKCC1 总蛋白水平。

背景

NKCC1（Na⁺-K⁺-2Cl⁻共转运蛋白1，SLC12A2）是阳离子-氯离子共转运蛋白家族中普遍表达的成员，介导Na⁺、K⁺和Cl⁻跨质膜的电中性共转运，在神经元、上皮细胞和其他哺乳动物细胞中，对细胞内Cl⁻积累、渗透平衡和细胞体积控制起着核心作用。该蛋白作为一种次级主动转运蛋白，利用内向的Na⁺梯度和由Na⁺/K⁺-ATP酶维持的K⁺梯度驱动一个Na⁺、一个K⁺和两个Cl⁻离子的净内流，这种离子移动有助于分泌上皮细胞中的NaCl跨上皮分泌，并导致许多神经元中Cl⁻浓度升高。 NKCC1与NKCC2和NCC同属CCC家族的Na⁺依赖性分支，广泛分布于脑、分泌腺、内耳、血管和其他组织中，参与多种基本生理过程，例如上皮细胞Cl⁻分泌、K⁺和Cl⁻稳态、细胞大小调节以及神经元兴奋性控制。该转运蛋白的特征在于其具有多个跨膜螺旋，这些螺旋构成离子转运核心；此外，其胞质N端和C端结构域较大，包含调控性磷酸化位点、与激酶和磷酸酶相互作用的基序以及膜转运和稳定性的决定因素，这些结构域使得NKCC1受到细胞体积和离子环境的严格调控。NKCC1作为分泌上皮细胞中Na⁺、K⁺和Cl⁻的基底外侧摄取途径；该蛋白支持顶端Cl⁻通过通道排出，并促进气道、肠道和外分泌腺的液体分泌。NKCC1活性是分泌性腹泻和气道高分泌等疾病中上皮分泌速率的关键决定因素。在神经系统中，NKCC1表达于神经元和胶质细胞，参与发育中和部分成熟神经元中Cl⁻的积累。其转运活性决定Cl⁻的平衡电位，从而影响GABA_A受体激活是去极化还是超极化，将NKCC1与抑制性与兴奋性GABA信号的调控以及神经元网络的兴奋性联系起来。 NKCC1也在星形胶质细胞中表达，参与离子组成和细胞体积调节，包括对细胞外K⁺升高和缺血状态的反应。在缺血状态下，NKCC1活性与NaCl内流、水进入和星形胶质细胞肿胀相关，并且该共转运蛋白对袢利尿剂（如布美他尼和呋塞米）具有药理学敏感性。NKCC1表达或调控的改变通过影响血管平滑肌和肾脏的盐处理参与高血压的发生发展，并导致脑缺血和多种神经系统疾病中的水肿和神经元过度兴奋；SLC12A2变异体作为人类疾病病因的基因鉴定证实了NKCC1是一种致病性离子转运蛋白，与神经发育、听觉和多系统表型相关。

使用信息

抗体应用

WB, IP, IHC, IF, FCM

稀释比例

WB	IP	IHC	IF	FCM
1:1000	1:30	1:100	1:100	1:150

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

131 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
IHC	实验步骤：脱蜡/补液 1. 脱蜡/水合切片： 2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。 3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。 4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。 5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾；在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。在工作台上冷却玻片 30 分钟。染色 1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。 2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。 3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。 5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。 6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。 7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。在加湿室中室温孵育 30 分钟。 9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。 10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。 11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。 12. 将载玻片浸入 dH2O 中。 13. 如果需要，用苏木精复染切片。 14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。 15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒；在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒；在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。 16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
IF	实验步骤：样品准备 1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。 2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。 3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。 4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。固定 1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。 2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。封闭添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。免疫荧光染色（第一天） 1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。 2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。免疫荧光染色（第二天） 1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。 2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。 3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。 4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光孵育 5~10 min。 5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。封片 1. 抗荧光淬灭封片剂封片。 2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。 3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: T84

IF

Validated by Selleck

Immunofluorescent analysis of T84 cells using F5166 (green, 1:100), Hoechst (blue) and tubulin (Red).