NKp46/NCR1 Antibody (Mouse mAb) [K17G8]

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生物描述

特异性 NKp46/NCR1 Antibody (Mouse mAb) [K17G8] 可检测内源性 NKp46/NCR1 总蛋白水平。
背景 NKp46，又称NCR1或CD335，是免疫球蛋白超家族的I型跨膜受体，是自然杀伤（NK）细胞的主要激活受体，并被广泛用作跨物种NK细胞谱系标志物。该受体包含一个胞外区，该胞外区含有两个Ig样结构域，可识别病原体来源和宿主编码的配体；一个跨膜区，该跨膜区含有一个带电残基，可介导与含ITAM结构域的衔接分子结合；以及一个不含内在信号转导基序的短胞质尾。 NKp46 与 FcRγ 和 CD3ζ 衔接蛋白结合，配体结合后诱导其 ITAM 磷酸化，募集并激活 Src 家族激酶和 Syk/ZAP-70，并通过以 LAT 和 SLP-76 为中心的复合物向下游传递信号，这些复合物与 PLCγ 连接，进而激活钙离子、MAPK 和转录因子程序，最终控制脱颗粒和细胞因子的产生。NKp46 可识别多种病毒和细胞配体，包括多种包膜病毒的血凝素和血凝素-神经氨酸酶，以及应激诱导或内质网应激相关的宿主配体。这种结合可触发穿孔素/颗粒酶的释放和 IFN-γ 的分泌，从而有助于清除受感染或转化的靶细胞。 NKp46在NK细胞上高表达且具有相对选择性，也存在于ILC1和NCR⁺ ILC3亚群以及部分γδ T细胞上。在这些细胞中，NKp46参与I型固有淋巴细胞的效应功能以及屏障组织的固有淋巴监视。在小鼠模型中，NKp46/Ncr1调控NK细胞和ILC1中TRAIL蛋白的表达，从而调节死亡受体介导的针对易感靶细胞的细胞毒性，将NKp46的激活与颗粒胞吐和TRAIL依赖性杀伤通路联系起来。NKp46的表达受细胞因子、微环境介质和代谢信号的调控。肿瘤或感染相关因子导致的表面NKp46表达下调与NK细胞活化受损相关，而NKp46的过表达或持续表达则增强其杀伤能力和细胞因子输出。 NKp46 在恶性 NK 细胞和某些 T 细胞系淋巴瘤中均可检测到，其存在可作为诊断标志物，并用于识别保留 NK 型激活受体机制的细胞。该受体是极具吸引力的治疗靶点，因为能够结合 NKp46、CD16 和肿瘤相关抗原的多功能 NK 细胞衔接器，通过将 NKp46-ITAM 信号通路与 Fc 和抗原驱动的突触形成相偶联，可诱导强烈的 NK 细胞活化和肿瘤细胞溶解。在感染、癌症和炎症等多种情况下，NKp46/NCR1 作为一个核心激活模块，将 NK 细胞和相关固有淋巴细胞上的配体识别转化为特定的 ITAM 依赖性信号级联反应、效应分子（如 TRAIL）的调控以及细胞毒性和细胞因子反应，从而塑造固有免疫监视和下游适应性免疫。

使用信息

抗体应用 WB, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IHC IF FCM
1:1000 1:40-1:200 1:40-1:125 1:4000
反应性 Human
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 34 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 在 20 μL 样品中加入蛋白上样缓冲液，可直接冰上备用；或通过温度梯度（如37 ℃煮样、50 ℃煮样、70 ℃煮样、90 ℃煮样、100 ℃煮样）来确定最佳变性条件，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IHC

Validated by Selleck

  • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded Mouse spleen tissue with F7890 at 1:100 dilution.