NLK Antibody (Rabbit mAb) [D1D21] Datasheet

生物描述

特异性	NLK Antibody (Rabbit mAb) [D1D21] 可检测内源性 NLK 总蛋白水平。
背景	Nemo样激酶（NLK）是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于MAP激酶家族，在神经组织中高表达，并参与多种调控细胞命运和组织稳态的信号通路。其激酶结构域具有非典型脯氨酸定向激酶的特征，NLK活性依赖于自身调节机制和蛋白质-蛋白质相互作用，这些机制和相互作用支持同源二聚体的形成和核定位，这与脊椎动物NLK同源蛋白的机制相似。NLK通过磷酸化TCF/LEF家族转录因子和其他Wnt通路组分来整合Wnt/β-catenin信号通路的输入，从而改变这些转录因子的活性，并在多个系统中降低β-catenin依赖性靶基因的表达。 NLK 还能响应 IL-6、TGF-β 和非经典 Wnt 配体等配体，并通过这些途径与其他通路相连，包括 JAK/STAT 相关的炎症通路和 Smad 依赖性生长因子信号通路，使 NLK 成为调控细胞增殖、分化、迁移和凋亡的细胞外信号的汇聚点。该激酶除了磷酸化 TCF/LEF 外，还能磷酸化一系列转录调控因子，包括 c-Myb、FOXO 蛋白以及 HDAC1 等共调节因子。这些修饰会影响底物的 DNA 结合、辅助因子募集或染色质结合，从而调节与细胞周期控制和应激反应相关的基因表达程序。NLK 的表达和功能活性在脊椎动物胚胎发生和神经系统发育过程中尤为显著，NLK 家族成员参与前部神经结构的模式形成、神经元分化的调控以及神经祖细胞中 Wnt 和 Notch 通路输出的协调。在各种癌症类型中，NLK的表达表现出情境依赖性变化，并与细胞增殖、迁移、侵袭或凋亡的改变相关。有报道称，NLK在某些肿瘤中作为Wnt/β-catenin驱动生长的负调控因子，而在另一些肿瘤中则作为致癌转录程序的正调控因子。NLK存在于细胞核和细胞质中，其亚细胞分布、相互作用蛋白和激酶活性决定了特定细胞类型中受影响的转录回路或信号通路分支，这使得NLK成为一个多功能节点，将细胞外信号输入与转录因子磷酸化以及下游功能结果联系起来，从而影响发育和疾病的发生发展。

特异性

NLK Antibody (Rabbit mAb) [D1D21] 可检测内源性 NLK 总蛋白水平。

背景

Nemo样激酶（NLK）是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于MAP激酶家族，在神经组织中高表达，并参与多种调控细胞命运和组织稳态的信号通路。其激酶结构域具有非典型脯氨酸定向激酶的特征，NLK活性依赖于自身调节机制和蛋白质-蛋白质相互作用，这些机制和相互作用支持同源二聚体的形成和核定位，这与脊椎动物NLK同源蛋白的机制相似。NLK通过磷酸化TCF/LEF家族转录因子和其他Wnt通路组分来整合Wnt/β-catenin信号通路的输入，从而改变这些转录因子的活性，并在多个系统中降低β-catenin依赖性靶基因的表达。 NLK 还能响应 IL-6、TGF-β 和非经典 Wnt 配体等配体，并通过这些途径与其他通路相连，包括 JAK/STAT 相关的炎症通路和 Smad 依赖性生长因子信号通路，使 NLK 成为调控细胞增殖、分化、迁移和凋亡的细胞外信号的汇聚点。该激酶除了磷酸化 TCF/LEF 外，还能磷酸化一系列转录调控因子，包括 c-Myb、FOXO 蛋白以及 HDAC1 等共调节因子。这些修饰会影响底物的 DNA 结合、辅助因子募集或染色质结合，从而调节与细胞周期控制和应激反应相关的基因表达程序。NLK 的表达和功能活性在脊椎动物胚胎发生和神经系统发育过程中尤为显著，NLK 家族成员参与前部神经结构的模式形成、神经元分化的调控以及神经祖细胞中 Wnt 和 Notch 通路输出的协调。在各种癌症类型中，NLK的表达表现出情境依赖性变化，并与细胞增殖、迁移、侵袭或凋亡的改变相关。有报道称，NLK在某些肿瘤中作为Wnt/β-catenin驱动生长的负调控因子，而在另一些肿瘤中则作为致癌转录程序的正调控因子。NLK存在于细胞核和细胞质中，其亚细胞分布、相互作用蛋白和激酶活性决定了特定细胞类型中受影响的转录回路或信号通路分支，这使得NLK成为一个多功能节点，将细胞外信号输入与转录因子磷酸化以及下游功能结果联系起来，从而影响发育和疾病的发生发展。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

58 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: SW480, Lane 2: HCT116, Lane 3: C2C12