NM23A Antibody (Rabbit mAb) [E3D15]

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生物描述

特异性 NM23A Antibody (Rabbit mAb) [E3D15] 可检测内源性 NM23A 总蛋白水平。
背景 NM23A，也称为NME1或NM23-H1，是NME/核苷二磷酸激酶家族的创始成员，它是一种多功能酶和信号调节因子，在核苷酸稳态、细胞骨架动力学、转录调控和转移抑制中发挥作用。该蛋白可与相关的NME亚型形成同源或异源六聚体，其活性位点组氨酸参与经典的乒乓磷酸转移机制，将末端磷酸基团从核苷三磷酸（主要是ATP）转移到多种核苷二磷酸，从而维持GTP、CTP、UTP和其他NTP的平衡合成，以用于DNA/RNA合成和GTP依赖性信号传导。它还具有多种催化活性，包括组氨酸蛋白激酶和3′–5′外切酶功能，并能与细胞核和细胞质中的DNA和蛋白质底物结合，使其处于核苷酸代谢、信号传导和DNA加工的交汇点。NM23-H1通过调节上游调控因子和小GTP酶的活性或可用性，负调控多种促侵袭信号通路，例如Rac1、MAPK/SAPK和PI3K-Akt通路。此外，它还影响肌动蛋白细胞骨架的组织和内吞运输，而这两者对于细胞迁移和基质侵袭都至关重要。核内NM23-H1与转录调控因子和染色质成分相互作用，并通过其外切酶活性以及与TREX1等核酸酶的协同作用，参与促转移基因的转录抑制和DNA损伤反应。在TREX1中，NM23-H1引入的切口有助于进一步加工受损的DNA链。该蛋白广泛表达，在肝脏、大脑、内分泌组织以及造血和上皮组织中含量尤为显著，并作为NME六聚体的一部分参与发育和分化过程，支持细胞增殖和特化功能。临床上，NME1最初是在高转移性肿瘤细胞中表达降低而发现的。低水平的NM23-H1或胞质定位与多种癌症（包括乳腺癌和神经母细胞瘤）的转移潜能增加和预后不良相关，而NM23-H1表达正常或定位于细胞核则与惰性行为相关。NM23-H1通过抑制促迁移信号通路和调节转录程序，抑制转移的多个步骤，包括局部侵袭和远处转移。其表达可受上游调控因子（如cAMP-PKA-CREB信号通路）的影响，该信号通路将细胞外信号与NME1依赖的转移能力调控联系起来。

使用信息

抗体应用 WB, IHC 稀释比例
WB IHC
1:1000-1:5000 1:100-1:250
反应性 Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 17 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 60 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:5000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HEK293T, Lane 2: HEK293T (KO NME1), Lane 3: Hela, Lane 4: Jurkat