NMDA Receptor 1 (GluN1) Antibody [D10D12] Datasheet

生物描述

特异性	NMDA Receptor 1 (GluN1) Antibody [D10D12] 可检测内源性 NMDA Receptor 1 (GluN1) 总蛋白水平。
背景	NMDA受体1 (GluN1)（N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基1）是所有功能性NMDA受体中必需的甘氨酸/D-丝氨酸结合亚基，这使其对几乎所有中枢神经元的受体组装和功能至关重要。从结构上讲，GluN1包含一个调节变构调节的胞外氨基末端结构域 (ATD)、一个结合甘氨酸或D-丝氨酸的双叶激动剂结合结构域 (ABD)、一个构成离子通道孔的跨膜结构域，以及一个与支架蛋白和信号传导蛋白（例如PSD-95、钙调蛋白和NF-L）相互作用的胞内羧基末端结构域 (CTD)；外显子5、21和22的可变剪接产生了八种具有不同调控特性的同工型。 GluN1 广泛表达于中枢神经系统，与 GluN2 (A–D) 亚基配对，有时也与 GluN3 亚基配对，形成异四聚体受体，其特性取决于亚基的组成。功能上，含 GluN1 的受体作为配体门控离子通道，需要谷氨酸（与 GluN2 结合）和甘氨酸/D-丝氨酸（与 GluN1 结合）才能激活，其电压依赖性的 Mg²⁺ 阻滞和高 Ca²⁺ 通透性使其在突触传递、长期增强作用、兴奋性突触后电流持续时间以及学习和记忆活动依赖性的突触可塑性中发挥关键作用。

特异性

NMDA Receptor 1 (GluN1) Antibody [D10D12] 可检测内源性 NMDA Receptor 1 (GluN1) 总蛋白水平。

背景

NMDA受体1 (GluN1)（N-甲基-D-天冬氨酸受体亚基1）是所有功能性NMDA受体中必需的甘氨酸/D-丝氨酸结合亚基，这使其对几乎所有中枢神经元的受体组装和功能至关重要。从结构上讲，GluN1包含一个调节变构调节的胞外氨基末端结构域 (ATD)、一个结合甘氨酸或D-丝氨酸的双叶激动剂结合结构域 (ABD)、一个构成离子通道孔的跨膜结构域，以及一个与支架蛋白和信号传导蛋白（例如PSD-95、钙调蛋白和NF-L）相互作用的胞内羧基末端结构域 (CTD)；外显子5、21和22的可变剪接产生了八种具有不同调控特性的同工型。 GluN1 广泛表达于中枢神经系统，与 GluN2 (A–D) 亚基配对，有时也与 GluN3 亚基配对，形成异四聚体受体，其特性取决于亚基的组成。功能上，含 GluN1 的受体作为配体门控离子通道，需要谷氨酸（与 GluN2 结合）和甘氨酸/D-丝氨酸（与 GluN1 结合）才能激活，其电压依赖性的 Mg²⁺ 阻滞和高 Ca²⁺ 通透性使其在突触传递、长期增强作用、兴奋性突触后电流持续时间以及学习和记忆活动依赖性的突触可塑性中发挥关键作用。

使用信息

抗体应用

WB, IP

稀释比例

WB	IP
1:1000	1:50

反应性

Human, Mouse, Rat

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

120 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

[1] Hansen KB, et al. J Gen Physiol. 2018 Aug 6;150(8):1081-1105.

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Mouse brain, Lane 2: Rat brain