NRF1 Antibody [A16D19] Datasheet

生物描述

特异性	NRF1 Antibody [A16D19] 可检测内源性 NRF1 总蛋白水平。
背景	NRF1是cap'n'collar CNC基本亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族的成员，它通过激活约50个核基因来协调核-线粒体通讯，这些核基因编码呼吸链亚基、线粒体转录因子（如TFAM）以及线粒体生物合成调节因子，而这些调节因子对于氧化磷酸化和细胞能量稳态至关重要。NRF1包含一个N端酸性转录激活结构域（STD），该结构域跨越氨基酸1至120，负责募集CBP和p300共激活因子；一个中央Neh1结构域，该结构域参与bZIP DNA结合并与NRF1、NRF2、GABPβ和MAFG等伴侣蛋白形成二聚体，识别T(C/G)GCCGCGCAG回文基序中的GC二元体；NRF1两侧是保守的富含丝氨酸的NST区和酸性AD区。一种分子量约为41 kDa的新表位neo-NRF1，在内质网应激后经DDP5或DBD1切割产生，其N端neo-STD暴露出来，从而发挥组成型活性并绕过经典的N-糖基化抑制。NRF1具有启动子特异性转录激活作用，它既能结合经典的细胞色素c氧化酶亚基启动子（如COXIV和COXVa），也能结合非经典位点（如TFAM、TFB1M或TFB2），从而诱导线粒体质量增加，线粒体DNA与核DNA的比例增加约两倍，增加嵴密度，并使复合物I和IV的呼吸能力提高约30%。neo-NRF1在蛋白酶体抑制的情况下维持氧化磷酸化（OXPHOS），而NST和AD基序介导p21的抑制并与细胞周期阻滞相关。 BNRF1通过调控肌生成素和Pax7驱动肌生成，通过线粒体运输支持神经元成熟，并且对红系分化和血红素生物合成至关重要。PGC1α通过ERRα和ERRγ的共激活增强NRF1的作用。NRF1单倍体不足会导致线粒体DNA耗竭，进而引发线粒体肌病；而在肝癌中，NRF1的过表达与E2F1激活和不良预后相关。

特异性

NRF1 Antibody [A16D19] 可检测内源性 NRF1 总蛋白水平。

背景

NRF1是cap'n'collar CNC基本亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族的成员，它通过激活约50个核基因来协调核-线粒体通讯，这些核基因编码呼吸链亚基、线粒体转录因子（如TFAM）以及线粒体生物合成调节因子，而这些调节因子对于氧化磷酸化和细胞能量稳态至关重要。NRF1包含一个N端酸性转录激活结构域（STD），该结构域跨越氨基酸1至120，负责募集CBP和p300共激活因子；一个中央Neh1结构域，该结构域参与bZIP DNA结合并与NRF1、NRF2、GABPβ和MAFG等伴侣蛋白形成二聚体，识别T(C/G)GCCGCGCAG回文基序中的GC二元体；NRF1两侧是保守的富含丝氨酸的NST区和酸性AD区。一种分子量约为41 kDa的新表位neo-NRF1，在内质网应激后经DDP5或DBD1切割产生，其N端neo-STD暴露出来，从而发挥组成型活性并绕过经典的N-糖基化抑制。NRF1具有启动子特异性转录激活作用，它既能结合经典的细胞色素c氧化酶亚基启动子（如COXIV和COXVa），也能结合非经典位点（如TFAM、TFB1M或TFB2），从而诱导线粒体质量增加，线粒体DNA与核DNA的比例增加约两倍，增加嵴密度，并使复合物I和IV的呼吸能力提高约30%。neo-NRF1在蛋白酶体抑制的情况下维持氧化磷酸化（OXPHOS），而NST和AD基序介导p21的抑制并与细胞周期阻滞相关。 BNRF1通过调控肌生成素和Pax7驱动肌生成，通过线粒体运输支持神经元成熟，并且对红系分化和血红素生物合成至关重要。PGC1α通过ERRα和ERRγ的共激活增强NRF1的作用。NRF1单倍体不足会导致线粒体DNA耗竭，进而引发线粒体肌病；而在肝癌中，NRF1的过表达与E2F1激活和不良预后相关。

使用信息

抗体应用

WB, IP, ChIP

稀释比例

WB	IP	CHIP
1:1000	1:100	1:100

反应性

Human, Mouse, Rat, Monkey

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

68 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 120 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/Nuclear Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 120 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Hela, Lane 2: HepG2, Lane 3: PC3