NUP98 (Nuclear Pore Marker) Antibody (Rat mAb) [L2D21]

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生物描述

特异性 NUP98 (Nuclear Pore Marker) Antibody (Rat mAb) [L2D21] 可检测内源性 NUP98 (Nuclear Pore Marker) 总蛋白水平。
背景 NUP98 是一种含有 GLFG 重复序列的核孔蛋白，由其前体经蛋白水解切割生成 NUP98 和 NUP96。NUP98 和 NUP96 是核孔复合物中两个位于核质侧的组分，参与核质转运、核孔生物合成和基因调控。NUP98 的 N 端富含苯丙氨酸-甘氨酸 (FG) 和甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸 (GLFG) 重复序列，这些重复序列形成柔性、固有无序的结构域，并延伸至转运通道内。而 C 端区域包含一个结构化的孔靶向结构域，该结构域可直接与其他支架核孔蛋白（例如 NUP96 和胞质核孔蛋白 NUP88）结合，从而将 NUP98 定位在核孔的核侧和胞质侧。这种结构使NUP98能够作为一种可移动的FG核孔蛋白，在核孔复合物（NPC）和核内聚集体之间穿梭，并作为核转运蛋白依赖性运输的对接平台和辅助因子，包括Crm1介导的核蛋白输出和importin-4介导的核蛋白输入。其中，NUP98的FG重复序列以RanGTP依赖的方式与Crm1或importin-4结合，促进受体-货物高效地穿过核孔。抗体阻断或NUP98的耗竭选择性地抑制大量mRNA和Crm1依赖性蛋白货物的输出，而破坏FG基序的突变减弱了其与输出和输入受体的结合，这表明NUP98对于RNA和蛋白质通过NPC的正常通量以及维持运输的选择性和方向性是必需的。NUP98还参与NPC的组装和质量控制。脊椎动物的NUP98对核孔的形成至关重要。近期研究发现，NUP98在核孔生物发生过程中发挥着检查点作用。NUP98调控缺陷会改变核孔复合物（NPC）的化学计量比，导致转运失衡，进而影响细胞周期进程和蛋白质稳态。此外，NUP98还通过与启动子和调控区域的染色质结合，并与CBP/p300等转录共激活因子以及RNA解旋酶DHX9相互作用，直接参与基因表达调控，从而调节发育和细胞周期基因的转录，并将NPC组成与核基因表达程序联系起来。 NUP98 基因位于 11p15.5 的抑癌区域内，是急性髓系白血病和相关血液恶性肿瘤中染色体易位的常见靶点。在 NUP98 中，NUP98 与同源异型盒蛋白（例如 HOXA9）或组蛋白甲基转移酶（例如 NSD1）融合，产生嵌合转录因子，这些转录因子异常激活 HOX 和其他发育基因，破坏正常分化，并驱动白血病发生，同时通常保留一个内源性 NUP98 等位基因以支持必要的孔道功能。

使用信息

抗体应用 WB, IF 稀释比例
WB IF
1:1000 1:100
反应性 Mouse, Rat, Human, African green monkey
抗体类型 Rat Monoclonal Antibody MW 198 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。(建议曝光时长 60s 以上)。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IF

Validated by Selleck

  • Immunofluorescent analysis of Hela cells using F4946 (green, 1:100), Hoechst (blue) and tubulin (Red).

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: HeLa nuclear, Lane 2: HeLa, Lane 3: Jurkat, Lane 4: SH-SY5Y