Ob-R/Leptin Receptor Antibody (Mouse mAb) [F2B5]

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生物描述

特异性 Ob-R/Leptin Receptor Antibody (Mouse mAb) [F2B5] 可检测内源性 Ob-R/Leptin Receptor 总蛋白水平。
背景 瘦素受体（Ob-R），又称瘦素受体或LEPR/CD295，是一种I类细胞因子受体，是脂肪细胞来源激素瘦素的高亲和力信号受体，也是连接脂肪能量储存与神经和外周通路（调控食欲、能量消耗和神经内分泌功能）的受体系统的核心。该受体通过选择性剪接产生多种亚型，包括具有信号传导能力的长亚型（Ob-Rb）和几种短的可溶性亚型；所有亚型均具有胞外结构域，该结构域包含细胞因子受体同源模块、参与配体诱导构象重排的免疫球蛋白样结构域以及激活所需的膜近端纤连蛋白III型结构域。其中，只有Ob-Rb具有延伸的胞内尾部，该尾部包含组装JAK2-STAT信号复合物所需的全部box1/box2基序和酪氨酸残基。瘦素与两个受体单体的细胞外 CRH2 和 Ig 结构域结合，稳定了一个高级复合物，该复合物使相关的 JAK2 激酶靠近，导致 Ob-Rb 胞质尾部特定酪氨酸的跨磷酸化和随后的磷酸化；这些磷酸酪氨酸募集 STAT3、STAT5 和其他效应分子，这些效应分子被激活并转移到细胞核，诱导 POMC 等厌食基因和 SOCS3 等负调控因子的转录，同时平行分支激活 SHP2–ERK/MAPK、PI3K–Akt 和 mTOR 信号级联，从而调节神经元兴奋性、交感神经输出和外周代谢。下丘脑弓状核和腹内侧核关键神经元群中Ob-Rb的表达，是瘦素通过刺激POMC/CART神经元和抑制AgRP/NPY神经元来抑制食物摄入和增加能量消耗的基础。因此，Ob-R信号通路将循环中的瘦素水平与决定体重设定点、自主神经张力和垂体激素分泌的中枢神经回路整合起来。短的膜结合型Ob-R亚型保留了胞外瘦素结合区，但胞质尾部截短，它们参与瘦素的转运和清除，并可通过JAK结合激活有限的信号通路。而可溶性亚型（Ob-Re）在血浆中循环，作为载体结合瘦素，调节游离激素的可用性，并可能促进瘦素向特定组织膜受体的递送。瘦素受体也存在于许多外周器官中，包括免疫细胞、内皮细胞和胃肠道上皮细胞。在这些器官中，Ob-R 的激活会影响 T 细胞增殖和细胞因子产生、血管生成、肠道上皮生长以及心血管功能，从而将瘦素的作用从能量平衡扩展到更广泛的免疫和血管稳态调节。Ob-R 信号传导失调与人类疾病密切相关：LEPR 基因的功能缺失突变会导致严重的早发性肥胖和神经内分泌异常；而在普通肥胖中，瘦素水平升高伴随 Ob-R/JAK-STAT 信号传导受损，构成了一种瘦素抵抗状态，该状态与持续性过度摄食、能量消耗减少和心血管风险增加有关。 Ob-R/瘦素受体是一种结构模块化的细胞因子受体，其长亚型Ob-Rb和辅助短/可溶性亚型将瘦素结合转化为下丘脑和外周靶点中协调的JAK-STAT、MAPK和PI3K-Akt信号传导。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF, ELISA 稀释比例
WB IP IHC IF
1:100- 1:1000 1:200-1:400 1:50-1:500 1:50-1:500
反应性 Mouse, Human, Rat
抗体类型 Mouse Monoclonal Antibody MW 132 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：5 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:100），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

Validated by Selleck

  • Lane 1: K562