Occludin Antibody (Rabbit mAb) [L16J4]

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生物描述

特异性 Occludin Antibody (Rabbit mAb) [L16J4] 可检测内源性 Occludin 总蛋白水平。
背景 闭合蛋白（Occludin）是一种四跨膜磷蛋白，也是最早被分子表征的紧密连接组分之一。它存在于上皮细胞和内皮细胞最顶端的接触位点，参与形成半透性的细胞旁屏障以及分隔顶端膜和基底外侧膜的膜内屏障。该多肽具有两个疏水性胞外环，以及富含带电荷和调控残基的胞质取向的N端和C端结构域。C端胞质尾部可结合支架蛋白（如ZO-1），并将闭合蛋白链连接到皮质肌动蛋白细胞骨架和信号复合物上，从而调控细胞连接的组装、维持和重塑。作为紧密连接链的一部分，闭合蛋白与紧密连接蛋白和连接粘附分子共定位并协同作用，以调节不同大小和电荷的溶质的细胞旁通透性。闭合蛋白已被证明具有细胞-细胞粘附分子的功能，参与在连接链部位建立密封，并维持膜内扩散屏障，防止脂质在顶端和基底外侧之间混合。闭合蛋白的调控高度依赖于磷酸化和其他翻译后修饰：C端结构域的丝氨酸/苏氨酸磷酸化与紧密连接的组装和屏障增强相关，而去磷酸化或酪氨酸磷酸化则与屏障破坏相关。包括蛋白激酶C、ERK1/2、p38 MAPK和Rho相关激酶在内的多种激酶通路参与调控闭合蛋白的定位、链稳定性以及对细胞因子、生长因子和机械应力的通透性变化。在血脑屏障内皮细胞中，闭合蛋白是连接完整性的关键决定因素。缺血性卒中模型显示，基质金属蛋白酶介导的切割、泛素化和炎症信号传导可降低闭合蛋白的表达或改变其磷酸化状态，从而增加屏障通透性，促进白细胞浸润和水肿。常压高氧疗法、小分子药物和肽类药物等新兴干预措施正在接受测试，以期在缺血性损伤后稳定闭合蛋白（occludin）并维持屏障功能。气道炎症研究强调了C端结构域的功能重要性：在炎症的人类肺组织中，闭合蛋白的表达降低；在支气管上皮细胞中过表达全长闭合蛋白可抑制LPS诱导的IL-8释放，恢复屏障完整性并限制F-肌动蛋白重塑，而C端缺失则会消除这些保护作用；合成的C端闭合蛋白肽可通过抑制p38活化、维持线粒体结构和减少线粒体活性氧来重现屏障保护和抗炎作用；体内肽预处理可提高LPS诱导的肺损伤的存活率，并减轻细胞因子水平和炎症浸润。更广泛地说，闭合蛋白（occludin）是细胞因子诱导的紧密连接调控所必需的。基因敲低研究表明，闭合蛋白的缺失会损害TNF-α和IFN-γ诱导的屏障特性改变，这支持了闭合蛋白作为信号转导平台介导连接对炎症信号的反应，而不仅仅是作为静态结构成分的作用。闭合蛋白的失调与炎症性肠病中的肠道屏障缺陷、血管床通透性增加和免疫激活有关，并且在某些癌症中闭合蛋白表达的缺失与去分化和侵袭性相关，这与其在维持细胞间黏附、极性和屏障组织方面的功能相一致。

使用信息

抗体应用 WB, IP, IHC, IF, FCM 稀释比例
WB IP IHC IF FCM
1:1000 1:40 1:200 1:100 1:60
反应性 Mouse, Rat, Dog, Human
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 59 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
WB
实验步骤：
 
样品制备
1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆或置于冰上超声裂解样品，静置30 min。
2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），超声处理以裂解细胞，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；
5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；
6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。
 
电泳分离
1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：10 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表
2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）
 
转膜
1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；
2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；
3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；
4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.45 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表
湿转法参考条件：200 mA, 120 min。
（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）
 
封闭
1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；
2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；
3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
抗体孵育
1. 用 一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；
2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；
3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；
4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。
 
显色
1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；
2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。
 
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

WB

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  • Lane 1: Caco-2, Lane 2: DLD-1, Lane 3: Mouse brain