Osteocalcin Antibody [G12E1] Datasheet

生物描述

特异性	Osteocalcin Antibody [G12E1] 可检测内源性 Osteocalcin 总蛋白水平。
背景	骨钙素（OCN），又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白（BGLAP），是一种由成骨细胞产生的49个氨基酸组成的非胶原蛋白，分子量约为5.6 kDa。它既是骨基质组织的关键调节因子，也是一种连接骨重塑与能量和生殖代谢的激素。骨钙素由BGLAP基因编码，以原肽形式合成，经加工后形成成熟形式，该成熟形式含有三个维生素K依赖性的γ-羧基谷氨酸（Gla）残基。这些Gla残基赋予骨钙素高负电荷，使其能够与骨内的钙离子和羟基磷灰石晶体牢固结合，从而使羧基化的骨钙素能够促进胶原纤维上的矿物质沉积，增强骨强度和抗骨折能力。未羧基化的骨钙素由于骨亲和力降低，优先释放到血液循环中，并在血液中作为内分泌配体发挥作用。骨钙素激活胰岛β细胞、脂肪细胞、骨骼肌和睾丸间质细胞上的G蛋白偶联受体（如GPRC6A），从而刺激胰岛素分泌和β细胞增殖，增强脂联素生成和胰岛素敏感性，促进葡萄糖和脂肪酸利用，并增加睾酮合成，使骨骼成为葡萄糖稳态、能量消耗和男性生育能力的调节器。骨钙素还通过大脑中的GPR158受体传递信号，调节神经递质合成和认知功能。临床上，血清骨钙素是骨质疏松症和代谢性骨病中骨形成和骨转换的动态标志物，其水平或羧化状态的变化与2型糖尿病、肥胖、心血管疾病以及潜在的神经精神疾病相关。

特异性

Osteocalcin Antibody [G12E1] 可检测内源性 Osteocalcin 总蛋白水平。

背景

骨钙素（OCN），又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白（BGLAP），是一种由成骨细胞产生的49个氨基酸组成的非胶原蛋白，分子量约为5.6 kDa。它既是骨基质组织的关键调节因子，也是一种连接骨重塑与能量和生殖代谢的激素。骨钙素由BGLAP基因编码，以原肽形式合成，经加工后形成成熟形式，该成熟形式含有三个维生素K依赖性的γ-羧基谷氨酸（Gla）残基。这些Gla残基赋予骨钙素高负电荷，使其能够与骨内的钙离子和羟基磷灰石晶体牢固结合，从而使羧基化的骨钙素能够促进胶原纤维上的矿物质沉积，增强骨强度和抗骨折能力。未羧基化的骨钙素由于骨亲和力降低，优先释放到血液循环中，并在血液中作为内分泌配体发挥作用。骨钙素激活胰岛β细胞、脂肪细胞、骨骼肌和睾丸间质细胞上的G蛋白偶联受体（如GPRC6A），从而刺激胰岛素分泌和β细胞增殖，增强脂联素生成和胰岛素敏感性，促进葡萄糖和脂肪酸利用，并增加睾酮合成，使骨骼成为葡萄糖稳态、能量消耗和男性生育能力的调节器。骨钙素还通过大脑中的GPR158受体传递信号，调节神经递质合成和认知功能。临床上，血清骨钙素是骨质疏松症和代谢性骨病中骨形成和骨转换的动态标志物，其水平或羧化状态的变化与2型糖尿病、肥胖、心血管疾病以及潜在的神经精神疾病相关。

使用信息

抗体应用

WB

稀释比例

WB

1:1000 - 1:10000

反应性

Human

抗体类型

Rabbit Monoclonal Antibody

MW

11 kDa

储存液配方

PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3

储存条件
(自收到货起)

-20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years

实验方法
WB	实验步骤：样品制备 1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。 2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。 4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液； 5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度； 6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。电泳分离 1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表 2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）转膜 1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中； 2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗； 3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好； 4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表湿转法参考条件：200 mA, 60 min。（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）封闭 1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min； 2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温； 3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。抗体孵育 1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜； 2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min； 3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h； 4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。显色 1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀； 2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

实验方法

WB

实验步骤：

样品制备

1. 组织样品：破碎组织，加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），低温匀浆。

2. 贴壁细胞样品：吸去培养基, 用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

3. 悬浮细胞样品：将培养基转移至离心管中离心，弃上清，用冰冷的 PBS 清洗细胞 2 遍。加入适量冰冷的 RIPA/NP-40 Lysis Buffer （含蛋白酶抑制剂Cocktail），冰上静置裂解 5 min。

4. 将所得匀浆液/裂解液置于离心机中 4°C 离心 15 min，收集上清液；

5. 取少量裂解液测定蛋白质浓度；

6. 加入蛋白上样缓冲液，将 20 µL样品在 95~100°C加热 5 min，冰上静置冷却后离心 5 min。

电泳分离

1. 根据所提蛋白的浓度，将适量蛋白样品和 Marker 上样至 SDS-PAGE 凝胶。建议分离胶（即下层胶）浓度：20 %。 SDS-PAGE 分离胶浓度选择参照表

2. 电源调 80 V, 30 min。然后电源调 110 V~150 V，观察 Marker，待蛋白所在的预染蛋白 Marker 指示带得到合适的分离后，即可停止电泳。（注意电泳时电流切勿过大，如超过 150 mA 会导致温度上升，容易影响跑胶结果。如无法避免采用大电流，可对电泳槽使用冰浴降温。）

转膜

1.拿出电转槽，把夹子和耗材浸泡在预冷电转液中；

2.用甲醇活化 PVDF 膜 1 min，用转移缓冲液冲洗；

3.按照“夹子黑边-海绵-滤纸-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-滤纸-海绵-夹子白边”的顺序安装好；

4.将蛋白电转移至 PVDF膜上。（推荐采用 0.22 µm PVDF 膜） PVDF 膜孔径规格选择参照表

湿转法参考条件：200 mA, 60 min。

（注意电转条件可根据蛋白大小适当调节，分子量大的蛋白适宜采用大电流，并延长转膜时间，但需要确保电转槽始终处于低温的环境中，避免凝胶融化。）

封闭

1. 电转移后，室温下用 TBST 洗膜 5 min；

2. 在封闭液中将膜孵育 1 h，室温；

3. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

抗体孵育

1. 用一抗稀释液配制一抗工作液（建议一抗稀释比 1:1000），4°C 条件下与膜轻柔摇晃孵育过夜；

2. 用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min；

3. 在封闭液中加入二抗，室温条件下与膜轻柔摇晃孵育 1 h；

4. 孵育结束后，用 TBST 洗膜 3 次，每次 5 min。

显色

1. 加入配制好的 ECL 发光底物（或根据二抗选择其他显色基质）混合均匀；

2. 与膜孵育1 min，去除多余底物（需保持膜湿润），置于显影仪中进行曝光。

文献参考

Application Data

WB

Validated by Selleck

Lane 1: Human Osteocalcin recombinant protein