Osteopontin Antibody (Rabbit mAb) [G3A21]

目录号：F8739

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生物描述

特异性 Osteopontin Antibody (Rabbit mAb) [G3A21] 可检测内源性 Osteopontin 总蛋白水平。
背景 骨桥蛋白（由SPP1基因编码）是一种高度磷酸化和糖基化的酸性糖蛋白，它既是基质相关蛋白，也是分泌型细胞因子，通过不同的结构基序与细胞表面整合素和CD44结合。翻译后修饰决定了其受体选择性：磷酸化的骨桥蛋白优先结合整合素受体，而去磷酸化的骨桥蛋白则倾向于与CD44结合。C端区域的O-糖基化进一步影响其与CD44的相互作用，同时也影响其对基质金属蛋白酶的蛋白水解敏感性。骨桥蛋白通过与整合素结合介导破骨细胞与矿化骨基质的黏附，直接支持调控骨重塑的骨吸收活性。这种黏附机制使骨桥蛋白成为破骨细胞骨架与骨表面之间的物理桥梁。在前列腺癌细胞中，骨桥蛋白与整合素αvβ3结合可激活下游信号通路，促进细胞表面CD44和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）复合物的形成，进而驱动MMP-9的分泌和酶活性，促进基质降解和细胞迁移；破坏骨桥蛋白的整合素结合RGD基序或抑制其表达可抑制CD44-MMP-9复合物的形成并降低细胞迁移能力。此外，骨桥蛋白的磷酸化使其能够通过丝氨酸和苏氨酸残基螯合钙离子，这使其翻译后修饰状态与调节骨组织内羟基磷灰石的形成和矿化动力学直接相关。绝经后骨质疏松症患者的血清骨桥蛋白浓度升高，且与骨矿物质密度呈负相关，尤其是在腰椎部位，这反映了该蛋白参与了骨吸收-骨形成失衡这一疾病特征。骨桥蛋白还参与炎症反应、细胞募集和组织修复过程，在纤维化、免疫介导和恶性组织环境中表达升高，将其整合素和 CD44 依赖性信号传导与疾病进展联系起来，使骨桥蛋白成为骨骼、炎症和肿瘤疾病的机制驱动因素和候选生物标志物。

使用信息

抗体应用 IHC, IF 稀释比例
IHC IF
1:500 - 1:2000 1:1000
反应性 Mouse
抗体类型 Rabbit Monoclonal Antibody MW 35 kDa
储存液配方 PBS, pH 7.2+50% Glycerol+0.05% BSA+0.01% NaN3
储存条件
(自收到货起)		 -20°C (avoid freeze-thaw cycles), 2 years
IHC
实验步骤：
 
脱蜡/补液
1. 脱蜡/水合切片：
2. 将切片在二甲苯中孵育 3 次，每次 5 分钟。
3. 将切片在 100% 乙醇中孵育两次，每次 10 分钟。
4. 将切片在 95% 乙醇洗涤液中孵育两次，每次 10 分钟。
5. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
6.抗原修复：对于柠檬酸盐：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐暴露溶液中，在微波炉中加热，直至开始沸腾； 在亚沸温度 (95°-98°C) 下继续煮 10 分钟。 在工作台上冷却玻片 30 分钟。
 
染色
1. 用 dH2O 清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
2. 将切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟。
3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 在洗涤缓冲液中洗涤切片 5 分钟。
5. 用 100–400 µl 封闭液在室温下封闭每个切片 1 小时。
6. 除去封闭液，并向每个切片中添加 100–400 µl 一抗稀释液。 4°C 孵育过夜。
7. 去除抗体溶液，用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 1-3 滴所需的 HRPA 覆盖切片。 在加湿室中室温孵育 30 分钟。
9. 用洗涤缓冲液洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
10. 使用前将 DAB 显色剂浓缩液加入 DAB 稀释液中并充分混合。
11. 在每个切片上涂抹 100–400 µl DAB 并密切监测。 1-10 分钟通常可提供可接受的染色强度。
12. 将载玻片浸入 dH2O 中。
13. 如果需要，用苏木精复染切片。
14. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
15. 切片脱水：95%乙醇孵育切片两次，每次 10 秒； 在 100% 乙醇中重复，孵育切片两次，每次 10 秒； 在二甲苯中重复，孵育切片两次，每次 10 秒。
16. 用盖玻片和封固剂封固切片。
 
IF
实验步骤：
样品准备
1. 贴壁细胞：取洁净无菌盖玻片置于培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片。
2. 悬浮细胞：将细胞接种至多聚赖氨酸包被的洁净无菌载玻片上。
3. 冰冻切片：将玻片置于室温下解冻，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。
4. 石蜡切片：先将玻片脱蜡至水，纯水或 PBS 摇洗 3次，每次 3 min。然后进行抗原修复。
 
固定
1. 使用固定液，如4%多聚甲醛（4% PFA）室温固定细胞爬片/涂片或组织切片 10~15 min。
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
通透
1. 对样品添加去垢剂，如 0.1~0.3% Triton X-100，室温通透 10~20 min。
（仅针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则可省略该步骤。）
2. 使用 PBS 摇洗样品 3次，每次 3 min。
 
封闭
添加封闭液，在室温下封闭至少 1 h。（常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或山羊血清。）
注意事项：从封闭开始之后的所有步骤务必保证样品湿润，避免干燥，否则极易产生高背景。
 
免疫荧光染色（第一天）
1. 吸走封闭液，滴加稀释后的一抗。
2. 湿盒中 4°C 孵育过夜。
 
免疫荧光染色（第二天）
1. 吸走一抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
2. 滴加稀释后的荧光二抗，避光 4°C 孵育 1~2 h。
3. 吸走二抗，PBST 摇洗 3 次，每次 5 min。
4. 滴加稀释后的 DAPI，室温避光 孵育 5~10 min。
5. PBST 中摇洗 3 次，每次 5 分钟。
 
封片
1. 抗荧光淬灭封片剂封片。
2. 干燥玻片，将玻片置于室温下避光过夜。
3. 将载玻片放入玻片盒中 4°C 避光保存。
 

Application Data

IHC

Validated by Selleck

  • Immunohistochemical analysis of formalin fixed paraffin embedded mouse kidney tissue with F8739 at 1:500 dilution.